生物制药质量控制分析方法的风险分析示例

ー　摘要　ー

为了降低下游生产过程中未完全清除的残留细胞DNA产生不良反应的风险，监管机构要求制药行业保证生物源药品中的残留细胞DNA水平非常低。过去使用的技术是放射性印迹杂交法。然而，在质量控制实验室中实施这项技术非常具有挑战性:费力、费时且是半定量的，并且需要使用放射性同位素。除了该方法，我们也评价了另外两种方法:阈值法和定量聚合酶链反应法。考虑到不确定性、可能的状况或未来事件以及它们对方法性能的影响，采用质量风险管理工具来对这些技术进行了对比。通过用DNA方法来演示这些工具的应用，我们提供了一个示例，说明如何使用它们来支持科学和实用的决策方法，以及如何使用这些工具来评估和管理方法性能风险。从质量风险管理的原则出发，本文探讨了利用风险分析工具-危害分析和关键控制点来开发和选择分析性质量控制方法的新途径。该工具使得找到对方法可靠性影响更大的方法程序步骤(称为关键控制点)成为可能。我们的模型得出的结论是，放射性斑点印迹法具有较多的关键控制点，其次是定量聚合酶链反应和阈值法。定量聚合酶链反应是检验残留细胞DNA较好的替代分析方法。

1. 介绍

生物药的货架期或稳定性(1)需要基于复杂的分析方法来评估，并证明蛋白质特性。残留细胞DNA (rcDNA)是量化生物技术产品中杂质的关键分析参数。由于每个表达系统的rcDNA都是独特的，所以它依赖于生产过程中使用的宿主生物和纯化过程。为了降低不良事件的风险，监管机构要求生产商保证生物技术产品的残留rcDNA处于低水平。最终散装产品的rcDNA一般应小于100 pg /治疗剂量(2 - 6)，或某些需要大剂量的生物制药，最多10 ng /剂量 (4)。要达到100 pg的限度标准，必须保证纯化工艺足够有效和稳健，能够清除数量级的DNA；还需要一种极其灵敏和可靠的分析方法来检测并定量中间体和纯化原料药中的rcDNA(4,5)。历史上常用放射性DNA杂交技术(放射性斑点印迹法)来测定此类产品中DNA含量。测定DNA含量的新方法基于几种检测技术，例如生物传感器技术。目前涉及DNA扩增、阈值法和定量聚合酶链反应(qPCR)两种技术可能对检测污染DNA有用。

1.1.定量rcDNA含量的替代测定法 

为了保证产品质量均一，监管机构已确定必须对生物来源药物中的rcDNA数量和大小进行控制(1,3,6 -8)。因此，认真选择检验分析方法非常重要，以便鉴定和量化这些产品中rcDNA的可能数量。

目前以下三种技术的灵敏度符合要求：杂交法、阈值法和qPCR(9)。这些方法都根据DNA单链键合反应产生的检测信号来进行，这种信号会释放出可捕获并被测量的放射性粒子或荧光底物。

1.2．质量风险管理(QRM)

为了确保整个生命周期中分析方法的可靠性，使用质量管理工具——特别是质量风险管理(QRM)——可对风险进行系统评估(10)。风险管理程序从识别可能存在的风险开始，以确保分析具备可靠、稳健的性能。风险评估过程是QRM的一部分，这是一个结构化过程，在决定是否需要额外的处置之前，通过分析风险发生的可能性和潜在的后果来定义是如何影响目标的。此外，制药行业和监管机构可以使用公认的QRM工具和/或内部程序来评估和管理风险(10)。

QRM由一种科学和实用的决策方法支持，基于当前关于评估风险的概率、严重性、有时甚至是可检测性知识，建立书面化、透明和可重现的方法来执行风险分析过程的步骤(10)。

为了给风险管理提供支持，制药行业和监管机构有多种非正式的程序，均基于观察项、趋势和其他信息来源的汇编。这种方法可以提供有用的信息来支持处理投诉、质量缺陷、偏差和资源分配(10,12)。

1.3. 危害分析和关键控制点(HACCP)方法

在这项工作中使用了危害分析和关键控制点(HACCP)工具，因为对于比较分析方法来说关键控制点(CCP)是有价值的。当需要一种更系统的方法来解决问题时，使知识变得更结构化和有组织，就可以使用HACCP工具。HACCP工具也可用于其他质量控制系统(13)。开发和选择分析方法时使用HACCP工具有很多优势，因为其基于识别和干预过程、评估和确认，可使其成为一个综合性的质量体系。

HACCP用于评估和监视危害(危害被定义为对可靠方法性能的影响)，可以通过方法监视系统来识别CCP并进行控制。这可使方法性能更可靠。在使用HACCP时需注意，对方法中固有CCP的数量和分布进行评估，以评价它们对整体操作的影响。

因此，必须建立程序来监测方法的性能情况，并在出现偏差时建立纠正措施。最后，就像任何监视系统一样，有必要定义如何对其进行管理和定期审查，以验证其是否达到预期效果(14,15)。这个过程是众所周知的，并进行过全面评估，从而使得方法受控，以及点对点预防操作更优，并可改进结果。

在确定所有关键控制点（简称CCP）之后，只要可能，必须确定它们的关键限度(14,16)。关键控制点（简称CCP）是那些可以进行控制的点，预防或消除对方法性能的危害或将其降低到可接受的水平是非常重要的。通过决策树(图3)可以很容易地确定HACCP系统中的关键控制点(CCP)，决策树有助于识别出所有可能影响危害的操作和技术因素。如果在需要进行控制的阶段识别到有危害，而在这一步骤中没有控制措施，则在这一点上应该修改方法，以确保该程序具备控制措施(17,18)。

2. 理论基础

2.1．风险管理 

尽管现行GMP已经建立了很长一段时间，但美国食品和药物管理局(FDA)仍签发了大量与QC相关的警告信，表明公司在分析方法上存在风险管理系统的问题(19)。

在制药行业，分析方法是最重要的，尤其是QC实验室。如果分析方法是可疑的，那么基于这些方法的所有决策都是可疑的。由于这些原因，能够评估分析方法的优劣是伦理和良好实践的问题(20)。评估方法优劣的最佳方法是同时考虑与之相关的几个点，通过评估方法固有的风险来实现。

通过风险评估来确定方法的关键变量，例如影响工艺过程的方面。一旦确定了这种技术，目标是关注方法开发，并包括与可变性相关风险的详细评估(19)。根据Santos-Reyes和Beard(21)的观点，安全不是一个孤立的因素;安全级别取决于相互关联的人员、组织设计、管理和过程。

对制药业来说，危害是潜在的危害来源(22)，可产生一系列不适当的做法，可能导致无效或缺乏疗效。简单地说，认为危害是产生不良影响的可能性。然而，根据ISO的说法，风险是存在的危害、发生的概率以及可能造成的影响或损害严重程度的相互联结(22)。例如，在制药行业，QRM是非常有用的，可在无菌工艺(23)、环境监测(24,25)、验证(26)和生产(27)等方面更好得对工艺过程进行评估。在生物制药行业中，没有专门的方法来涵盖所有的监管要求，主要是因为可以使用多种方法来评估风险(28)。

2.2．生物制药质量控制(QC) 

方法的性能特性非常重要，可影响实验室建立和开展特定分析技术的决策制定。Mehta和Keer(4)收集了一些实验室预期存在的9个因素，并按重要性进行排序:可靠性、灵敏度、法规遵从性、公认的行业方法、易用性、工作量、每次测试花费、分析灵活性和设备成本。从这个意义上说，这项工作的目的之一是在选择分析方法时对与特定方法相关的风险进行评估，以改进和提供更好的支持。

2.3.今天HACCP 

自19世纪50年代中期建立以来，HACPP工具几乎只在食品工业中使用。然而，近年来已被扩展到其他领域以促进与物理、化学、生物危害相关的风险的识别和管理：化工和制药行业(30、31)，饮用水供应(32)，制备抗癌药物(33)，医疗设备使用(34)，甚至应用于医院管理实现优先级患者安全(35)。

在这个工作中，使用HACCP工具可为识别与分析方法相关的CPP方面提供必要支持，提供方法选择和比较的另一个方面, 最重要的一点是对方法性能的影响: 与方法学相关的风险。

2.4. HACCP在制药行业的应用 

风险分析已经延伸在制药领域，通常被用作获得强健工艺过程的基础。然而，HACCP工具还没有被广泛用于风险评估，因为大多数公司最初的目标是将风险作为纠正目标而不是预防性目标进行分析。无论如何，HACCP是监测制药业过程参数的一个适当工具(14,27,36)。

ICH在其质量风险管理指南(Q9)(10)中声称:“HACCP可以用于识别和管理与物理、化学和生物危害(包括微生物污染)相关的风险。当对产品和工艺的理解足够全面，以支持关键控制点的识别时，HACCP是最有用的。HACCP分析的输出项是风险管理信息，它不仅有助于监控生产过程中的关键点，还能监控其他生命周期阶段。＂

除了用来比较分析方法以及其内在的风险，HACCP工具可能带来有利的点，公司将其包括在他们的生物制药QC方法中，可构成另一个有趣的考虑点。

HACCP工具可以提高质量控制实验室方法性能的可靠性，原因在于它可

●帮助识别验证应该主要关注的内容,

●基于质量控制测试，注重预防措施而不是依靠纠正措施,

●有能力适应变化，如先进的设备设计和处理程序，或技术的升级。

3. 方法

3.1. 总体信息 

本研究旨在利用HACCP风险分析工具，针对药典推荐的方法，建立一种新的生物制药质控方法的选择标准。

生物制药中用于检测污染物DNA (rcDNA)的技术通常从两个方面进行探讨：定性评价(放射性探针—斑点印迹杂交法)和定量评价(qPCR和生物传感器技术的阈值分析法)(9)。

有必要通过分析它们(rcDNA定量分析的可能来源)的流程图和石川图来比较它们的异同。同样，为了进行比较，有必要列出所有危害、原因和对建立CCP的影响，可能的话列出关键限度。

3.1.1.数据收集: 

首先，对方法进行调查; 随后对方案进行研究提供科学依据。与一个多学科小组讨论，以支持使用HACCP。此外，按照美国药典操作手册(9)对推荐的污染物DNA检验方法进行了调查(9)。

HACCP的执行需要一个经验丰富的、多学科的团队，收集关于识别、评估和促进处理、减少或消除每个方法/过程的相关风险措施的广泛远景。多学科小组包括组长、QC和质量保证分析师，以及研发专家。

3.1.2. 流程图及石川图设计:

使用流程图、内部指南和标准操作程序(SOP);这些说明了应该使用什么软件以及如何绘制流程图。除了科学方案和制造商手册外，还使用了国家和国际立法规范。

针对流程图进行分析从而设计了石川图。它的构造帮助直观地展示了一个特定问题或效果的许多潜在原因。在缺乏定量数据进行分析和促进减轻或消除风险的行动的情况下，它特别有用(37)。

当发现有偏差时，有必要实施纠正和预防措施系统，但这只有在找到根本原因时才有可能(14)。通过使用石川图工具，可以将重点放在根本原因上，这将有助于在关键控制点确定方面实施HACCP。

3.1.3. HACCP的实施:

之所以选择HACCP工具，主要是因为它可以在不需要偏差记录、结果和干扰过程的情况下使用，并且突出了工艺过程的优缺点。Bonan等人(33)强调，在HACCP方法中，危害是通过监控过程检测出来的，并通过定义操作来解决。

HACCP工具的主要目的是确定关键控制点。应用CCP决策树可以确定某个特定步骤是否是针对先前确定的危害的CCP。然而，这仅仅是一个工具，而不是HACCP的强制性元素。关键控制点决策树不是专家知识的替代品(31)。

4. 结果

4.1.流程图 

流程图可帮助对工艺过程进行详细审视，并增加了对方法程序如何工作的理解，有助于识别可能的故障、影响和解决方案(37,38)。然后，从收集到的信息中，设计了构成这项工作的三种方法的详细流程图(数据未显示):放射性斑点印迹、qPCR和阈值分析法。这些流程图可用来设计石川图，然后验证每种方法的危害、原因和效果。在图1中显示了每种方法的一般流程图。

 

4.2. 石川图（鱼骨图）

Mehta和Keer(4)指出，一个分析过程有三个阶段(主要因素)可能发生变异:样品制备、分析测量和分析，如图2所示。在本研究中，主要问题集中在rcDNA测量的可变性上。由于所研究的方法具有相同用途(DNA定量)的共同特征，因此不同的方法可能会出现类似的风险。根据这些信息，设计了一个石川图，涵盖了与方法开发的每个阶段相关的可变性或风险的一般来源(图2)。

与第一个因素(样品制备)相关的原因表达了两个依赖水平。这个因素越针对于每种方法的原因，就越接近于确定问题的根源。样品制备的主要原因是样本偏差、样品准确性、样品的完整性和稳定性。

主要与第二个因素(措施)有关的是DNA目标量、工作条件、灵敏度和交叉污染。最后，对于第三个因素(分析)，以下是相关的: 性能控制、结果判断和数据记录，以及使用的标准。

对于每个主要原因，跟踪次要因素等等，这些原因提炼了问题并指导团队找到符合根本原因的答案。例如，我们可以看到，通常情况下，样品制备过程中产生的偏差受到自身条件和操作者干扰篡改的影响。在测量原因方面，这些误差主要与设施、设备和操作人员有关。分析中的可变性原因主要与操作者能力和移液器分级特性有关。在所有情况下，可以通过培训、提高意识和集中精力执行测试来最小化人员的影响。

人们注意到，rcDNA的定量方法显示出了可变性的来源，其中包括检测效率、设备和操作员干扰、校准和测量误差。

4.3. HACCP的实施 

4.3.1. 危害、原因和影响表:

为了帮助应用HACCP工具来识别危害、原因、影响、检测和缓解措施，使用了另一个GRQ工具的基础(初级危害分析(PHA))。根据ICH指南(10)，PHA是识别危险、危险情况和可能造成损害事件的分析工具，然后识别可能的缓解措施。

放射性斑点印迹法包括用放射性探针检测固定在硝基纤维素或尼龙薄膜上的目标核酸。因此，分析人员暴露在放射性物质中，即使试验试图使用冷探针，其特异性也较低，可能对结果产生负面影响。因此，这种方法中的CCP数量相当多。

通过对每个测试的流程图和设计的石川图进行分析，为每种检验方法制作了一个表格，详细描述了相关的危害、原因、与之相关的影响以及这些危害的检测和减轻可能性(数据未显示)，每个步骤分开。表1、表2和表3进行了总结。这些表对于深入分析风险非常重要，以便帮助检查方法的每个步骤中的关键点。

在放射性斑点印迹法测试结果的8个步骤中观察到25个危害，观察到qPCR 5个步骤有14个危害，观察到阈值分析法5个步骤有19个危害。这些表格还显示，各自的试验尽管不同，但其中许多危害表现出相似的原因、影响、检测和缓解措施(数据未显示)。这使我们得出这样的结论：所有三种测试都有一些共同的危险，例如交叉污染、体积超标和数据错误解释——这使得我们关注到人员和仪器的问题上。

放射性斑点印迹法具有半定量方法的特点，不使用设备来读取结果，因此它允许对结果有不同的解释。在其他一些情况下，设备与定量结果相关联，从本质上讲，变异性与仪器校验/确认/验证(CQV)有关，通过定期建立CQV很容易解决这一问题。放射性斑点印迹法和阈值法共同的一个重要点是与DNA分子变性温度范围相关的危害。研究发现，加热块对两种方法的影响都很大，这使得非常有必要使用确认过的供应商以避免工艺失败。

DNA分子变性是这些方法中最重要的一步，因为这些分析方法的检测原理取决于在测试过程中获取DNA单链。斑点印迹法需要将DNA单链附着在膜上，这样就有可能将另一条DNA单链与辐射标记的DNA单链杂交，从而检测到信号。qPCR需要使DNA双链变性，开始连锁反应扩增分子。然而，阈值分析法是一种基于DNA单链结合蛋白的方法。

另外值得一提的是，qPCR和阈值分析法具有合格的试剂盒和特定用途，放射性斑点印迹与其不同，它是一个内部分析方法，需要所有的试剂必须在实验室由操作员自己制备，要求对操作团队操作检验进行确认，以及频繁修订来维持这些特征。这增加了测试不确定性，从而造成了结果的可变性。因此，放射性斑点印迹成本很高，表现在所需时间、劳动和谨慎处理方面，这增加了风险和对预期结果的负面干扰的可能性。

总的来说，为了减轻检验风险，良好的操作是最重要的。

4.3.2. CCP识别:

对测试方法的每一步骤进行细致分析以及在CCP决策树帮助下(图3)，可以确定威胁到方法过程测定的那些点(表I、II、III)。因此对于已识别到的CCP，如有可能根据之前类似过程获得的信息建立其关键限度，因为这些限度只能在验证过程中确定。执行替代方法时应对这些要点进行验证。无论如何，应监测所列的关键点，以确保它们保持在建议的限度内;否则需要采取纠正措施，偏差应正式记录在合规文件中(17,18)。

在这项工作中，控制点(CP)被认为是可能影响过程性能的非关键点或步骤;然而，主要可通过先决程序和良好实践程序来对这些要点进行控制。因此，更系统的方法可以促进整个产品生命周期的持续改进和创新(39)。

通过分析每个测试中的CCP，可以得出这样的结论：传统的含量测定方法(放射性斑点印迹法—表I)是CCP数目最多的方法，总共16个CCP，并且8个步骤中其中5个步骤具备至少50%的危害，大量的CCP来自于此。其次是qPCR有6个CCP，然后是阈值分析法有5个CCP。此外，与阈值分析法相比，qPCR每个阶段的PCC数量更低。

在这个比较分析中，一个有趣的事实是放射性斑点印迹法与其他替代方法的CCP数量差别。也许这一比例与检测能力甚至检测方法的灵敏度有关，强调放射性斑点印迹法是一种半定量分析方法，qPCR的CCP约比放射性斑点印迹法少63%，而阈值分析法的CCP数量约比放射性斑点印迹法少69%。与放射性斑点印迹相比，除了CCP数目更少外，qPCR和阈值分析法都可给出定量结果。因此，qPCR和阈值分析不仅更敏感(5,16)，而且证明是更好的生物制药QC方法。

考虑选择分析方法的三个最重要的因素(可靠性、灵敏度、法规符合性)(4)，qPCR和阈值分析法符合FDA的可接受灵敏度标准，即检测治疗剂量为100pg/DNA限度。这两种都被美国药典(9)收录，是可选的DNA定量分析方法(qPCR和DNA结合蛋白)，因此其法规符合性是相同的。剩下的是最重要的因素：可靠性，本研究结果显示，qPCR有6个CCP，而阈值分析法有5个CCP。然而阈值分析法的大多数CPP(80%)都集中在一个步骤(5个CCP中4个来自于该步骤)——工作站量化(设备)，而qPCR的CCP分布在三个步骤，两种方法都有五步试验(表II和III)。这个阈值分析法的PCC分布特征可能代表一个关键问题，缓解措施不能减少与该方法相关的危害和风险,或者，与qPCR相比，减少风险的主要努力不值得花费的时间/费用。这些缓解措施体现在项目安装确认和运行确认上。对此，也可以说这一步对于确保DNA变性是至关重要的，方法的耐用性必须符合要求。

此外，在比较这些备选方法时，值得考虑的一些要点是：(1)商业工具包的可用性；(2)技术援助；(3)关键控制点的数量。

关于第一点，方法是等同的，因此市场上都有商业试剂盒; 这些操作使用的原材料的供应不是问题，因为这方面有合格的供应商。同样，在第二点上，这两种方法也是等同的，因为设备的制造商负责提供技术援助。第三点是非常关键的一点，因为阈值分析法表明，其中大部分的方法CCP集中到单一步骤，在过程中是非常关键的，并取决于设备的性能。另一方面，qPCR不仅具有更大的技术领域，而且更加敏感。另一个事实是，尽管阈值分析法CCP比qPCR少，但该方法存在的危害更多，共有19至14种。

因此,对放射性斑点印迹的两个替代方法进行分析，并与样品体积、方法的性能特征(成本/测试、检测限、样品流和灵敏度)(3、5)一起考虑, 特别是考虑到已识别的危害和CCP，—与阈值分析法相比，在量化生物制药产品DNA方面，qPCR具有更高的可靠性、安全性和再现性。

5．讨论

应该定期审查为一个过程设置的所有流程图，以确保它们是最新的(38)，记住这对经常使用的任何过程或验证的测试都非常重要，无论是在质量控制或还是生产中。

使用HACCP工具来建立CCP被证明是有效的，这些CCP为对本研究中的分析方法进行比较奠定了基础。HACCP是一种精确的方法，它可以突出问题，详细解释复杂的过程，并可能将有限的资源集中在确定的关键点上。最后，风险分析还可实现对文件化数据的审查，例如SOP、生产和检查方案。

有人指出，作为另一个QRM工具的基础来帮助研究HACCP分析到的危害是非常重要的。因此，可用PHA的基本原则来协助调查危害、产生原因、影响、检测和缓解措施。

质量风险管理中常见到一些工具组合使用，这也是经常的做法。一个工具可以覆盖其他工具不能覆盖的方面。在这项工作中，使用PHA来支持HACCP是非常有效的，因为在这个领域过去没有研究历史。

评价定量rcDNA的放射性斑点印迹替代方法时，应考虑到可影响qPCR和阈值分析法的国家和国际法规。考虑到采用HACCP程序对其过程中的危害进行分析，并考虑到选择一种方法所固有的几个方面，最后得出结论，评价的最佳替代分析方法是qPCR。这主要是因为它易于操作和设备性能; 其次，所列出的关键点对选择方法有很大的帮助。

       文章来源：转载

       本网站刊载的所有内容，包括文字、图片、音频、视频、软件等，如非标注为“原创”，则相关版权归原作者所有，如原作者不愿意在本网站刊登相关内容，请及时通知本站，我们将第一时间予以删除。