为何要做qPCR验证？如何去筛选基因进行验证？

随着基因测序技术的发展以及测序成本的降低，RNA-seq 凭借高通量、高灵敏度、应⽤范围⼴等优势，已成为转录组研究的主要方法。 RNA-seq 技术流程主要包含两个部分：建库测序和生物信息分析。
建库测序部分 ，绝大多数课题组都是前期按实验设计和送样要求将样品采集后送至生物公司进行建库和生物信息分析，但有些课题组已经有条件和能力进行生物信息分析，所以总的来说，做转录组学研究需要学生要做的就是利用公司反馈的数据进行生物学分析，研究数据背后所所暗含的生物学意义，因为需要参考大量文献去分析和解读。
我们都知道RNA-Seq技术是转录组学研究的一项技术，测序报告反馈给我们的数据是定量参考，参数改变，那么后续的分析结果就会收到影响而变化，所以需要进行qPCR验证，表达水平的结果最终以实时定量PCR为准。
多数期刊的文献反映验证的基因数目在10-15个左右，但是我们在做实验的时候可能就要在20个基因左右。原因有些同学发现在做完qPCR验证实验后，数据分析显示基因的表达模式与RNA-Seq测序的结果不一致，遇到此类情况，不要慌，这是正常现象。
相信准备做转录组以及已经做了转录组的同学看文献就会发现很多SCI文章都有实验验证部分，且文章中的结果还是和自己的测序报告的结果一致的! 但自己的实验总是有那么几个基因结果不是很好。表急，表慌！！！其实呢，发了SCI的作者在做验证实验时，可能只是选取了结果比较好的10个基因来进行展示的，其他验证结果不好的、与预期结果不符或者自己不能阐述清楚的原因的部分基因则选择不在文章中呈现了，这就是建议大家再做验证试验的时候多选几个基因进行验证的原因啦!
但是呢，具体验证多少个基因就要看目标杂志水平和要求了。一般的文章验证20个左右就足够了。在RNA-Seq实验中设计生物学重复的，如果重复样本间相关系数高，只需要验证你关心的基因就行了。

下面介绍下挑选做验证的基因的一般建议:
第一、在做验证实验时要想明白，验证实验不要为了验证而验证，最好还应该有生物学意义。 那就是 最好选择验证几个目标或者候选基因，把从这些基因差异中得到的结论说清楚， 后续你还可以做进一步验证和表征这几个候选基因的功能，做单个基因家族分析，基因编辑，以及在翻译水平如小RNA，蛋白质，代谢等等研究，进一步更深层次的研究其生物学意义。
第二、建议可以先从GO和KEGG的富集分析结果入手，结合相关文献， 筛选自己的感兴趣的基因（与自己的研究方向相关的）。尤其是KEGG通路富集图，从它的图上可以得到很多信息。RNA-Seq反馈给我们的数据信息是非常大的，但是我们不能全部挖掘，所以这里小编建议同学可以根据自己的研究方向以及文献进行某一点的深入挖掘分析，解读其背后的生物学意义。
第三、筛选基因的原则：
1、样本间表达差异倍数大(log2(FC))；
2、基因表达量高(至少在一个样品中的表达量RPKM/FPKM大于50)；
3、基因测序深度readcount相对较高，如有些研究人员选择readcount大于20；
4、基因长度。这几条标准的指标目前没有统一固定的标准，需要研究人员根据自己的研究需要进行选择。这只是最开始筛选基因的原则，等把基因找到了之后，也许这个基因设计不出来合适的引物，所以可以找到基因后还需要看看能不能按照实时定量引物设计原则设计出好的引物。
最后提醒大家一下下，由于两种技术本身存在较大差异，用qPCR验证RNA-Seq结果，同一个基因在两种检测手段下，基因表达定量的值以及差异倍数有差异，所以小编建议大家在分析方面，可以参考基因上/下调的表达模式来进行相关分析。
第四、有些同学已经根据自己的研究方向和兴趣把要验证的基因都筛选好了，但不要忘了还有参考基因要选择。
1、根据自己的研究对象来选择，有些物种已经有前人把其他一些参考基因在其研究的物种上研究过了，把哪些基因在哪些环境下更稳定做了阐述，那么大家可以直接参考选取参考基因啦！
2、就是选择在任何物种任何环境下都比较稳定的基因来做参考基因，这个也是需要大家查阅文献滴！

       文章来源：微生态

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