【收藏】疏水层析影响因素解析

疏水层析填料的选择
*不同的配基的疏水填料与蛋白的结合能力强弱不同，在进行疏水层析时要对不同的疏水填料进行筛选对比。

*同一配基的疏水填料由于配基密度不同，其和蛋白的的疏水作用力也不同，筛选填料时也要对不同的配机密度的疏水填料进行对比筛选。
样品的性质
蛋白质的疏水性强弱取决于其表面疏基团的分布，同时与样品缓冲液的离子强度，离子种类，pH,所处的温度都有一定的关系，在进行疏水层析时要保持恒定的温度，且要对样品缓冲液的离子种类及离子强度，pH进行筛选对比分析。
层析柱反压升高或柱效下降

确保压力的升高是由层析柱引起的
检查在线滤器；从组分收样器开始断开管线，观察压力变化排除其他原因造成的压力升高。

层析柱使用过程杂质的积累
对填料进行清洗：先用0.5M的氢氧化钠洗1CV,然后用去离子水把碱洗掉（5CV),之后在用30%的异丙醇洗1CV，异丙醇洗完后用去离子水洗5CV，上样1CV 1mg/ml胃蛋白酶溶液（溶于0.1M乙酸，0.5M氯化钠，降解沉淀在层析柱上的蛋白），室温过夜，再用1.5CV 0.2M NaOH清洗，再用4CV去离子水清洗。

柱床太高
疏水层析装填高度建议在10-20cm，大于20cm反压增大。

流速过快
使用适当的流速。

层析填料被污染或老化
随着填料的使用，一些杂质的积累会使层析填料的孔径发生变化（如堵塞，非特异性吸附积累，微生物污染，破碎等），导致其排阻能力发生偏差而影响分离度。此时可对填料进行CIP清洗，若清洗后还不能达到分离要求，就要更换新的填料。
层析柱进气泡
大量进行很好脱气的去离子水反相冲洗平衡层析柱（30cm/h），气泡会被逐渐带出层析柱。
洗脱时没有收到目标物质或者洗脱量太少

目标物没有与介质结合或结合量较少 
先确认目标物质是否和填料结合

洗脱时间不够
降低流速，延长洗脱液的保留时间 

目标物质和填料结合强度太高
降低平衡液中盐浓度或更换盐的种类 或或更换结合能力较弱的疏水介质在 洗脱液中加入添加剂（少量去污剂或 者低浓度有机试剂）

层析缓冲液及温度
确保疏水层析时的温度适宜，且选择合适的缓冲液。
疏水层析时目标物不与填料结合或结合量较低
*确保合适的保留时间（上样速度）。
*目标物质和填料疏水作用力太弱，更换疏水性强的填料。
*缓冲液的离子强度太低，提高缓冲液的离子强度。

       文章来源：允咨生物GMP学苑

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