做标准曲线的12个经典问题

标准曲线的制作中，会有这样那样的问题，比如，常有人问：一定要做5个点？线性相关系数R值必须几个9才达标？标曲是每天都做还是每次都做？标曲是否必须通过原点？……

本文整理了标曲相关问题，一起来看看吧！

1、标准曲线的制作依据？

GB/T22554-2010《基于标准样品的线性校准》中：
1）标准曲线的浓度范围应覆盖正常操作条件下的被测量范围；
2）标准样品的组分尽量与被测样品组分一致；
3）标准样品的浓度值应等距离的分布在被测量范围；
4）标准样品的个数至少应有3个浓度；
5）每个标准点至少重复2次，这个重复是指从稀释开始；

如果国家标准有相应的浓度系列推荐，尽量按国家标准。工作中我们经常采用线性校准，因为线性方程最为简洁。

2、什么是校准曲线？

校准曲线包括标准曲线和工作曲线，前者用标准溶液系列直接测量，没有经过预处理过程，这对于样品往往造成较大误差；而后者所使用的标准溶液经过了与样品相同的消解、净化、测量等全过程。

3、首先标曲要做几个点？

标准曲线需要几个数据点，是由所检测组分的浓度范围、分析仪响应特性、干扰因素、浓度与检测信号响应类型有关的。

3个点：对于一些低浓度，特别是微量分析，并且浓度范围不是很大的，检测器响应可靠，背景干扰非常小的，则可以选用较少的工作点就行，一般有3个浓度点就足够了，有些甚至可以只用一个浓度点就行，另一个点直接用坐标原点。

4~6个点：对于平时测量的样品浓度范围较宽，并且检测器响应不完全是一次曲线（直线）的，可以采用二次曲线或分段校正方式，以减少数据偏差，这种情况就需要多用几个数据点，如果不分段，数据点有4~6个就够用。

至少两个点：但如果是分段校正，则每段需要至少两个数据点。而对于一些样品无浓度范围规律的，特别是一些检测机构，如果分析仪的检测响应可靠，环境因素影响少的，可以做校正曲线。若是环境因素影响大的，则不必做校正曲线，而采用标准加入法或标准加入-一次稀释法反而简便一些。

实际上，我们一般是做五个点（不包括零浓度）；一般以检出限的5~10倍为第一个点，以后根据1倍递增，最高浓度是最低浓度的10~20倍为宜（理化分析实验为例）。当然，要根据仪器的灵敏度来调整。

4、标曲R值是几个9才合格？

实验室应按检测标准（方法）的要求使用标准溶液或标准物质建立标准曲线。所用标准溶液或标准物质应覆盖被测样品的浓度范围。检测标准（方法）如无具体的要求，至少使用5个标样（除空白外）建立线性标准曲线，每个点重复测定1-3次，对于筛选方法，线性回归方程的相关系数不应低于0.98，对于确证方法，相关系数不应低于0.99。

其实，大于0.99是判断是否为线性相关的一个标准，实际应用中线性大于0.999才是比较理想的。线性在0.99到0.999之间的监测结果只用接近最高浓度一半（中间浓度）的位置才比较准确，如果线性大于0.999的话，在整个线性范围内都会有一个比较满意的结果。

如果检测的线性不好，可以减少标准的覆盖范围，将标准的浓度调整到待测样品浓度附近，这样结果也是非常准确的。例如，样品的浓度约20ppb，但在0~50ppb范围建立标准曲线，但线性非常不理想，这时可以将标准范围调整到15~25ppb之间，作五个标准。

5、标准曲线的检验？

（1）线性检验：
即检验校准曲线的精密度。对于以4～6个浓度单位所获得的测量信号值绘制的校准曲线，分光光度法一般要求其相关系数|r|≥0.9990，否则应找出原因并加以纠正，重新绘制合格的校准曲线。

（2）截距检验：
即检验校准曲线的准确度，在线性检验合格的基础上，对其进行线性回归，得出回归方程y=a+bx，然后将所得截距a与0作t检验，当取95%置信水平，经检验无显著性差异时，a可做0处理，方程简化为y=bx，移项得x=y/b。在线性范围内，可代替查阅校准曲线，直接将样品测量信号值经空白校正后，计算出试样浓度。
当a与0有显著性差异时，表示校准曲线的回归方程计算结果准确度不高，应找出原因予以校正后，重新绘制校准曲线并经线性检验合格。在计算回归方程，经截距检验合格后投入使用。

回归方程如不经上述检验和处理，就直接投入使用，必将给测定结果引入差值相当于解决a的系统误差。

（3）斜率检验：

即检验分析方法的灵敏度，方法灵敏度是随实验条件的变化而改变的。在完全相同的分析条件下，仅由于操作中的随机误差导致的斜率变化不应超出一定的允许范围，此范围因分析方法的精度不同而异。例如，一般而言，分子吸收分光光度法要求其相对差值小于5%，而原子吸收分光光度法则要求其相对差值小于10%等等。

6、标准曲线有效期的规定？

（1）标准曲线属于实验室质量控制的范围，按照《实验室资质认定评审准则》中结果控制的要求：定期使用有证标准物质（参考物质）进行监控和/或使用次级标准物质（参考物质）开展内部质量控制。

（2）准则中并未对“定期”进行规定，所以如果“定期”，就根据实验室的实际情况来定了。

（3）既然准则上没说明，那根据一般的分析教材，当实验条件（包括药剂、人员、仪器等）发生变化时，最好重新制作标准曲线。一般来说仪器如果长期使用，并经过检定，是处于稳定状态，而人员药剂的变化往往会较大。如果说每次换个人操作都要换曲线，那工作量就太大了。

7、每次开机都必须做标准曲线？

从药品检测的要求来说，因为：

1、每天所配的流动相都会有所不同，导致出峰的时间都会有一定的差异，峰面积相应都有所差异。

2、检测器光能也在不断的衰弱，因此其每天的相应值也有所不同，其峰面积也有差异。

基于以上原因，原则上应该是每天都要进行标准曲线校正的。

标准曲线不要每次都做，但是每次必须进标准品样品；因为每次你的流动相和原来的不可能完全一样，同时仪器的状态也在变化，所以不同批次间的保留时间是不一致的，所以你必须用随行标准品来定位与定量。

8、校准曲线能不能长期使用？

每批样品应测定一个校准曲线中间点浓度的标准液，其测定浓度与校准曲线标准点的浓度相对误差不得超过规定范围，如果超过规定相对误差，需重新绘制校准曲线。

也可以这样说，不同的分析项目，不同的分析方法，校准曲线斜率的稳定性不同。如校准曲线的斜率较为稳定，则在样品分析时，可只测定两个标准点，当此两个标准点与原曲线相应点的相对偏差均小于5%时，可使用原校准曲线。因此，样品分析前，需根据斜率的稳定性来确定是否需同时制作校准曲线。

我们一般的做法是，根据检测的频率来做，如果该项目天天都要检测，并且检测量较多时，要求至少每周做一次曲线。如果检测量上，一个月都没有几单的话，就一个月做一次曲线。当然，仪器如果出现故障并大修后回来的，经过检定后，需要重新做曲线。

9、标准曲线是否必须过原点？

标准曲线不一定非要过原点，只要线性好就可以了。因为做空白的话基本上不会过原点。过原点是强制过的，实际曲线可能不过，就会造成误差。不过原点是因为有系统误差。

针对是否过原点(0，0)问题，可以从原点(0，0)代表的意义来考虑：

即所测组分浓度为零的时候，信号响应值（液相色谱也就是峰高或者峰面积）是否也为零。通常来说色谱分析是属于这种情况的，因而可以把（0，0）点作为一个浓度水平计入标准曲线（甚至不需要真的去配一个浓度为零的标准溶液来进样），这也是单点法定量的一个依据；而类似的情况在光谱法测定时就讲不通了，浓度为零的标准溶液（本底）响应信号（吸光度）往往不是零，这个时候标准曲线就不一定过原点了。

10、标准曲线的线性范围？

线性范围这个大家都比较清楚，主要从相关系数r看，一般要求r大于等于三个九。之前做实验有时候浓度高时，线性不好，高浓度点不在标准曲线上，而是在标准曲线的下面，而且离拟合的标准曲线比较远。遇到这种情况，标准曲线的线性相关系数就很差，有时候才一个九，最后我终于想明白了，如果自己用手动拟合的话，用平滑的曲线去连接所有点的话，你就会发现，如果在线性范围内，连接起来就是直线，如果超出了线性范围，连接起来就是一条弯曲的曲线。

11、相关系数的有效数字？

GB5750.3-2006 8.2.7项有如下规定：校准曲线相关系数只舍不入，保留到小数点后出现非9的一位，如0.99989→0.9998。如果小数点后都是9时，最多保留小数点后4位。

12、Y=bX和二次曲线的选用？

标准曲线我们通常采用的是Y=a+bX，曲线拟合完必须要做统计检验，且要做统计完备的线性检验和失拟检验，然后再做a与0的差别检验，如果a与0的统计学上无差异，你就可以考虑用Y=bX的拟合曲线，拟合出来后同样做线性检验和失拟检验，如果线性检验合格（P<0.05）且失拟检验合格（P>0.05）此时你就可以采用Y=bX。

二次曲线的采用同样是这样的道理，如果你Y=a+bX时拟合不合格，你就考虑用Y=a+bX+cX2，同样做失拟检验，考察拟合的符合情况。如果Y=a+bX和Y=a+bX+cX2都满足拟合检验和失拟检验合格，则采用Y=a+bX形式，这样符合统计学上参数最少的统计简洁性原则。

标准曲线法有一定的优势，也有一定的缺陷，它特别适合于大量样品的分析。但由于每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品），而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。

了解各个分析项目校准曲线斜率的稳定性及影响稳定性的主要因素，可决定是否能采用带标点检验原校准曲线，省略重新制作校准曲线;从校准曲线斜率的变化，可判断标准溶液的稳定性，从而确定其标定周期;分析低浓度样品时，应使用高纯度的水和试剂，以减少空白值，降低样品的分析误差。

科学地运用校准曲线，对于降低分析成本、提高检测质量有着重要的意义。

       文章来源：制药工程论坛

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