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聊一聊CAR-T细胞中的共刺激域

嵌合抗原受体(CAR)-T细胞治疗可能是过去十年免疫治疗中最重大的突破,随着CAR-T细胞技术越来越成熟,CAR结构的组成,特别是细胞内结构域也在不断进化。第一代(G1)CAR-T细胞结构包含肿瘤相关抗原的高亲和力单链抗体(scFv)、跨膜结构域和唯一的细胞内TCR-ζ或FcR-γ结构域。G1 的临床益处有限,主要是由于其增殖能力低和体内细胞毒性有限。为了克服这一缺点,第二代(G2)CAR结构配备了额外的细胞内共刺激结构域,最显著的是CD28或TNFRSF成员4-1BB。这些G2 CARs被证明是非常有效的,几种CAR-T产品在治疗血液瘤方面获得了监管部门的批准。
第三代(G3)CAR-T结构包含了共刺激结构域的组合,而第四代(G4)和第五代(G5)CAR-T细胞包含额外的共刺激结构域,在抗原识别时诱导表达细胞因子(例如IL-12),或包含某些细胞因子受体的细胞内结构域(例如,截短的IL-2受体β链和STAT3结合部分)。在此,我们来一起回顾了TNFRSF的细胞内共刺激结构域在增强和调节CAR-T细胞活性方面的应用。

4-1BB的共刺激结构域
4-1BB是一种关键的共刺激受体,在TCR-MHC相互作用时的T细胞上快速上调。其配体4-1BBL在抗原呈递细胞(如巨噬细胞和树突状细胞)上表达。4-1BBL与4-1BB的结合导致TRAF1、TRAF2和TRAF3向4-1BB的胞内结构域募集。随后,形成了包含多种蛋白质(包括激酶和泛素连接酶)的4-1BB信号复合体,并最终启动关键信号通路,如NF-kB和PI3K-AKT。最终,4-1BB信号诱导细胞毒性T细胞的增殖、促炎细胞因子的分泌以及效应和记忆T细胞(Tm)的扩增。
4-1BB的细胞质信号结构域是CAR-T细胞结构中应用最早、探索最多的TNFRSF成员。与CD28 CAR-T细胞相比,4-1BB共刺激产生具有明显代谢特征的CAR-T细胞,如T细胞表面GLUT1表达减少和线粒体呼吸增加。这些差异也反映在CAR-T细胞表型和功能上。例如,CD19靶向CAR-T细胞中的4-1BB共刺激在小鼠模型中产生了更有效的B-ALL清除,并且4-1BB CAR-T比CD28共刺激的CAR-T细胞持续时间更长。
目前,共有三种使用了4-1BB的CAR-T细胞产品,即Tisagenelecluel(Kymriah)、Liscabatagene-Maraluel(BREYANZI)和Idecabatgene-Vicluel(ABECMA),已获得FDA批准。Tisagenlecleucel是一种CD19靶向G2 CAR-T细胞,在93例DLBCL患者进行的临床试验中,其产生了强大的药效(52%,ORR;40%,CR;12%,PR)。此外,观察到强烈但可控的3级或4级副作用,如89.7%的患者出现可逆性细胞因子释放综合征(CRS),9名患者出现可逆性神经精神事件(31%)。
Liscabatagene-Maraluel是另一种CD19靶向的G2 CAR-T细胞产品,含有4-1BB结构域,额外表达表皮生长因子受体(EGFR)的截断版本。这种设计考虑到安全性,在需要时,可以使用Cetuximab清除CAR-T细胞。在对256例复发或难治性大B细胞淋巴瘤患者进行的临床试验中,其ORR和CR分别为73% 和53%。
第三种4-1BB CAR-T细胞产品IdecabtageneVicluel是FDA批准的第一种治疗多发性骨髓瘤的CAR-T细胞疗法,其靶向多发性骨髓瘤细胞上表达的B细胞成熟抗原(BCMA)。在难治性和复发性多发性骨髓瘤(rrMM)患者中的II期临床试验中,其ORR为73%,CR达到33%,26%的患者达到了最小残留病灶(MRD)阴性状态。此外,在另一项3期研究(NCT03651128)中,与标准治疗相比,Idecabtagene显著改善了ORR(76.4% vs 32.2%)、PFS(11.6vs 3.5个月)和OS(20.2 vs 14.7个月)。
为了将T细胞效应器功能与T细胞记忆诱导结合起来,并实现更持久的临床反应,已经开发出包含CD28和4-1BB共刺激结构域的G3CAR-T结构。与G2 CAR-T细胞相比,G3 CAR-T细胞的治疗触发了重要细胞内信号分子(如LAT、ZAP-70、SYK和ERK)的更多磷酸化。因此,G3 CAR-T细胞产生更多的IL-2,具有更高的增殖能力和更好的体内持久性。
几项研究探索了4-1BB G3 CAR-T细胞的临床应用,在四名复发性惰性B细胞或套细胞淋巴瘤(MCL)患者中进行了一项小型试验,以测试针对靶向CD20的CD28和4-1BB G3CAR-T细胞的安全性,该试验证明其总体上安全且耐受性良好。值得注意的是,其中2名患者CR,并且在12个月和24个月内没有进展,即使在输注后1年,血液中也能检测到CAR-T细胞。此外,针对其他靶点的G3 CAR-T细胞也进行了评估。例如,前列腺癌靶抗原(PSMA)G3 CD28和4-1BB CAR-T细胞也显示出强大的抗肿瘤活性。
总之,在CAR-T细胞结构中加入4-1BB共刺激结构域可改善CAR-T细胞的体内持久性,增强记忆形成,并降低耗竭标记物的表达。在结合4-1BB和CD28共刺激的G3 CAR-T细胞构建中,与G2 CAR-T细胞相比,获得了更高的增殖能力和更好的体内持久性。并且迄今为止发现CD28和4-1BB G3 CAR-T细胞安全且耐受性良好。然而,考虑到CAR-T细胞应用中的某些共刺激结构域用于治疗特定类型的癌症,因此,在得出明确结论之前应小心谨慎。

OX40的共刺激结构域
另一个被探索作为CAR-T细胞共刺激剂的TNFRSF成员是OX40。OX40仅在MHC-TCR参与时在T细胞上上调,OX40信号增加T细胞的持久性并诱导记忆性T细胞(Tm)的形成。OX40信号还触发克隆扩增并上调抗凋亡蛋白的表达,如Bcl-2、Bcl-xL和Bfl-1,从而促进活化T细胞的存活。
OX40和4-1BB在功能上有许多相似之处,但它们在调节CD4+和CD8+T细胞反应方面存在明显的活性差异。OX40和4-1BB实际上在腺病毒感染时调节CD8+ T细胞克隆扩增方面具有相反的作用,OX40缺陷的CD8+T细胞显示CD8+T细胞扩增减少,而4-1BB缺陷的CD8+T细胞实际上表现出高反应性,导致CD8+T细胞数量增加。此外,T细胞分化为功能性效应细胞需要OX40,而4-1BB导致启动早期分化水平降低。
与CD28 G2 CAR-T相比,OX40G2 CAR-T细胞产生更多IFN-γ、同等水平的IL-2和类似的CAR-T细胞增殖反应。更重要的是,OX40 G2 CAR-T细胞产生的IL-10水平显著降低。相应地,与CD28 G2 CAR-T细胞相比,针对癌胚抗原(CEA)的G3 CAR-T细胞中CD28与OX40的联合刺激降低了IL-10的水平,并阻止了CAR-T细胞的自动抑制。此外,CD28/OX40共刺激使CAR-T细胞在重复抗原结合时免于激活诱导的细胞死亡。
许多早期证据表明OX40是一种很有希望用于CAR-T细胞的共刺激结构域。它能防止自身抑制,拯救活化诱导的细胞死亡,以及优越的细胞毒性活性。目前,靶向双唾液酸神经节苷脂(GD2)阳性实体癌(如黑色素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤和一些其他肉瘤)的CD28/OX40CAR-T细胞是正在治疗转移性黑色素瘤的临床试验(NCT02107963)中进行评估。

CD27的共刺激结构域
CD27的表达存在于CD4+和CD8+T细胞、NK细胞和启动的B细胞上。CD27的配体CD70在抗原呈递细胞上表达,包括DC和巨噬细胞。在激活T细胞上的CD27后,下游信号通过NF-κB诱导激活,导致T细胞活化、分化和克隆扩增。
与G1 CAR T细胞相比,在SKOV3人卵巢癌细胞-小鼠模型中,CD27 G2 CAR-T细胞具有增强的抗原刺激效应器功能、上调抗凋亡蛋白的表达、增强的体内持久性和增强的肿瘤消退。在该模型中,CD27 G2 CAR-T细胞和4-1BB或CD28 G2 CAR-T细胞之间未观察到差异。然而,与CD28介导的共刺激相比,CD27共刺激增强了CAR-T细胞的持久性。
临床上,在34例神经母细胞瘤患者中,以GD2为靶向的CD27/CD28 CAR-T细胞治疗产生15%的PR和38%的SD,一年生存率为74%。在另一项最近关于CD27/CD28 CAR-T细胞的临床研究中,CLL1靶向CAR-T细胞在AML患者中被证明是安全的。令人印象深刻的是,在这项研究的四名患者有3名显示CR,MRD阴性,可以继续进行造血干细胞移植(HSCT)。这些患者的副作用仅限于1至2级CRS。
值得注意的是,激活CD27也可诱导CD8+T细胞的终末分化、耗竭和凋亡。事实上,IL13Rα2靶向的G2 4-1BB CAR-T细胞表面组成性表达的CD27分子大大减少了CAR-T细胞的增殖,并诱导其耗竭和凋亡。
总之,CD27介导的共刺激可以增强不同的CAR-T细胞特征,如CAR-T细胞的持久性和细胞毒性。临床上,CD27/CD28共刺激组合在神经母细胞瘤、AML和淋巴瘤患者中产生了令人印象深刻的反应。然而,在CAR-T细胞结构中,CD27和其他共刺激分子的组合也应仔细考虑,以避免终末分化和耗竭。

CD40的共刺激结构域
CD40在髓源性抗原呈递细胞上表达,如树突状细胞(DC)、粒细胞和巨噬细胞。CD40配体(CD40L)主要在活化的T细胞和NK细胞上表达。在APC上,CD40与CD40L的结合激活抗原呈递和共刺激信号,从而促进细胞毒性T细胞的激活和扩增。
在最初的研究中,无论是G2型还是带有CD28结构域的G3型,CD40或4-1BB CAR-T细胞之间的抗原特异性靶细胞杀伤均未观察到差异。然而,与4-1BB共刺激相比,CD40共刺激确实触发了更强的NF-κB激活。
为了增强共刺激信号,CD40 CAR-T细胞已与CAR结构中的其他共刺激分子结合,例如与B细胞信号部分的CD79A结合,这两种受体都激活下游的NF-κB、NFAT和AP-1信号。与CD28或4-1BB共刺激的CAR-T细胞相比,CD79A/CD40CAR-T细胞在体外与CD19表达细胞共培养时,NF-κB和p38活性升高,增殖更多。在接种Raji肿瘤细胞的小鼠中,与CD28或4-1BB共刺激的CAR-T细胞相比,CD79A/CD40共刺激的CAR-T细胞也具有更好的抗肿瘤活性和增殖活性。

HEVM和GITR的共刺激结构域
HVEM和GITR最近也被纳入到CAR-T细胞结构中。HVEM具有免疫刺激和免疫抑制功能,并与配体CD160、BTLA、LIGHT和LTα相互作用。HVEM在各种免疫细胞上表达,包括T细胞、B细胞、NK细胞和树突状细胞。HVEM与LIGHT或LTα的结合导致T细胞活化和增殖,而HVEM与T细胞表达的BTLA的结合抑制T细胞活化。此外,HVEM还调节CD8+T细胞的效应器和记忆形成。
到目前为止,HVEM作为CAR-T细胞的共刺激结构域仅被报道过一次,与对照CD28或4-1BB G2 CAR-T细胞相比,HVEM G2 CAR-T细胞表现出增强的抗肿瘤细胞毒性和促炎细胞因子生成,例如IL-2、TNF-α和IFN-γ。此外,HVEMG2 CAR-T细胞中的CAR-T耗竭降低,并且检测到Tcm和Tem细胞的等效百分比。相比之下,在CD28和4-1BB CAR-T细胞中,Tem和Tcm亚群分别高度富集。因此,HVEM G2 CAR-T细胞似乎产生了更平衡的CAR-T细胞表型。有趣的是,在体外的HVEM CAR-T细胞中检测到糖酵解和线粒体呼吸水平增强。因此,HVEM共刺激似乎增加了能量代谢,这一特征与T细胞耗竭减少正相关。
CAR-T共刺激域的另一个TNFRSF成员是GITR。与4-1BB或OX40不同,GITR在T细胞上呈组成性表达,在CD4/CD25/Foxp3阳性Treg上的表达高于幼稚或记忆性T细胞。此外,在TCR激活后,效应T细胞上GITR的表达上调。GITR激动剂抑制Treg的抑制活性并提高效应T细胞的存活率。
在EGFR靶向的CAR-T细胞中,GITR共刺激产生的抗肿瘤活性与各种肿瘤细胞系中CD28或4-1BB G2 CAR-T细胞相当,甚至更强。靶向CD19的GITR G2 CAR-T细胞在体内也显著抑制了Raji肿瘤细胞的生长。此外,与共刺激CAR-T结构域DAP-10、CD28、4-1BB、ICOS和OX40相比,GITR共刺激在T细胞淋巴瘤和黑色素瘤模型体内表现出更强的细胞毒性。然而,与CD28 CAR-T细胞相比,GITR共刺激确实减少了TNF-α、IL-2和Th17相关细胞因子的分泌,并诱导了更分化的效应器表型,同时降低了体内持久性。

总结与展望
在CAR-T细胞中添加的各种TNFRSF成员的共刺激域中,不同的TNFRSF成员之间具有明显优势和劣势。显然,通过选择和/或组合不同的共刺激域,可以极大地影响和驱动CAR-T细胞的效果。
在这方面,在最近的比较中,临床产品中通常使用的CD28和4-1BB共刺激结构域明显优于其它共刺激结构域,包括OX40、ICOS或CD27。因此,进一步工程化CAR-T细胞的细胞内结构域可能产生增强的功能。例如,OX40共刺激结构域类似于4-1BB,可用于增强CAR-T细胞的持久性,但与CD28共刺激结构域相比,其对效应器功能的激活减少。GITR共刺激结构域可用于驱动效应器功能,但与CD28一样,与持久性降低有关。此外,在激发持久的抗癌反应方面,OX40共刺激被证明优于4-1BB共刺激,而CD40 CAR-T细胞似乎对内源性免疫也有强烈的刺激作用。
特别是,G3或G4 CAR-T细胞中不同共刺激结构域的组合可能产生额外的临床益处,因为不同的CAR-T细胞功能可以组合以产生协同活性。例如,通过结合CD28和OX40共刺激结构域,早期效应器表型与持久性和持久性抗肿瘤反应相结合,优于CD28/4-1BB结合的CAR-T细胞。在另一种G3 CAR-T细胞方法中,CD28分别结合4-1BB和CD40的共刺激,后者显示出最有效的共刺激效应。

此外,除了确定要选择CAR-T细胞结构中TNFRSF家族的哪个成员外,还应注意ICD结构域的顺序、要选择哪个跨膜结构域以及铰链/间隔区的设计。共刺激域在CAR结构中的定位可以极大地影响CAR-T细胞的功能,并决定是否可以从共刺激域获得额外的益处。
最后,还要考虑TME的影响。最近的研究表明,用环磷酰胺预处理可有效地修饰免疫抑制性TME,从而在转移性前列腺癌和胰腺癌模型中产生靶向PSCA的4-1BB CAR-T细胞的持久治疗反应。此外,调节CAR-T也可能有助于修饰TME,OX40 G2 CAR-T细胞产生的抗炎分子IL-10水平明显低于CD28 G2 CAR-T细胞。与CD28 G2 CAR-T细胞相比,G3 CAR-T细胞中的CD28联合OX40刺激也降低了IL-10水平,并阻止了CAR-T细胞的自动抑制。因此,CD28和OX40联合刺激可能适用于靶向免疫抑制TME的CAR-T细胞。
不同TNFRSF成员的不同作用仍在探索中,我们对这一独特家族的理解可能还存在差距。尽管如此,这些成员的全部潜力被释放只是时间问题,无论是单独还是与其他TNFRSF成员联合使用。很明显毫无疑问,在下一代CAR-T细胞中,TNFRSF成员将继续发挥核心、多样和重要的作用。

       文章来源:健康界

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