聊一聊CAR-T细胞中的共刺激域

嵌合抗原受体（CAR）-T细胞治疗可能是过去十年免疫治疗中最重大的突破，随着CAR-T细胞技术越来越成熟，CAR结构的组成，特别是细胞内结构域也在不断进化。第一代（G1）CAR-T细胞结构包含肿瘤相关抗原的高亲和力单链抗体（scFv）、跨膜结构域和唯一的细胞内TCR-ζ或FcR-γ结构域。G1 的临床益处有限，主要是由于其增殖能力低和体内细胞毒性有限。为了克服这一缺点，第二代（G2）CAR结构配备了额外的细胞内共刺激结构域，最显著的是CD28或TNFRSF成员4-1BB。这些G2 CARs被证明是非常有效的，几种CAR-T产品在治疗血液瘤方面获得了监管部门的批准。
第三代（G3）CAR-T结构包含了共刺激结构域的组合，而第四代（G4）和第五代（G5）CAR-T细胞包含额外的共刺激结构域，在抗原识别时诱导表达细胞因子（例如IL-12），或包含某些细胞因子受体的细胞内结构域（例如，截短的IL-2受体β链和STAT3结合部分）。在此，我们来一起回顾了TNFRSF的细胞内共刺激结构域在增强和调节CAR-T细胞活性方面的应用。

4-1BB的共刺激结构域
4-1BB是一种关键的共刺激受体，在TCR-MHC相互作用时的T细胞上快速上调。其配体4-1BBL在抗原呈递细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）上表达。4-1BBL与4-1BB的结合导致TRAF1、TRAF2和TRAF3向4-1BB的胞内结构域募集。随后，形成了包含多种蛋白质（包括激酶和泛素连接酶）的4-1BB信号复合体，并最终启动关键信号通路，如NF-kB和PI3K-AKT。最终，4-1BB信号诱导细胞毒性T细胞的增殖、促炎细胞因子的分泌以及效应和记忆T细胞（Tm）的扩增。
4-1BB的细胞质信号结构域是CAR-T细胞结构中应用最早、探索最多的TNFRSF成员。与CD28 CAR-T细胞相比，4-1BB共刺激产生具有明显代谢特征的CAR-T细胞，如T细胞表面GLUT1表达减少和线粒体呼吸增加。这些差异也反映在CAR-T细胞表型和功能上。例如，CD19靶向CAR-T细胞中的4-1BB共刺激在小鼠模型中产生了更有效的B-ALL清除，并且4-1BB CAR-T比CD28共刺激的CAR-T细胞持续时间更长。
目前，共有三种使用了4-1BB的CAR-T细胞产品，即Tisagenelecluel（Kymriah）、Liscabatagene-Maraluel（BREYANZI）和Idecabatgene-Vicluel（ABECMA），已获得FDA批准。Tisagenlecleucel是一种CD19靶向G2 CAR-T细胞，在93例DLBCL患者进行的临床试验中，其产生了强大的药效（52%，ORR；40%，CR；12%，PR）。此外，观察到强烈但可控的3级或4级副作用，如89.7%的患者出现可逆性细胞因子释放综合征（CRS），9名患者出现可逆性神经精神事件（31%）。
Liscabatagene-Maraluel是另一种CD19靶向的G2 CAR-T细胞产品，含有4-1BB结构域，额外表达表皮生长因子受体（EGFR）的截断版本。这种设计考虑到安全性，在需要时，可以使用Cetuximab清除CAR-T细胞。在对256例复发或难治性大B细胞淋巴瘤患者进行的临床试验中，其ORR和CR分别为73% 和53%。
第三种4-1BB CAR-T细胞产品IdecabtageneVicluel是FDA批准的第一种治疗多发性骨髓瘤的CAR-T细胞疗法，其靶向多发性骨髓瘤细胞上表达的B细胞成熟抗原（BCMA）。在难治性和复发性多发性骨髓瘤（rrMM）患者中的II期临床试验中，其ORR为73%，CR达到33%，26%的患者达到了最小残留病灶（MRD）阴性状态。此外，在另一项3期研究（NCT03651128）中，与标准治疗相比，Idecabtagene显著改善了ORR（76.4% vs 32.2%）、PFS（11.6vs 3.5个月）和OS（20.2 vs 14.7个月）。
为了将T细胞效应器功能与T细胞记忆诱导结合起来，并实现更持久的临床反应，已经开发出包含CD28和4-1BB共刺激结构域的G3CAR-T结构。与G2 CAR-T细胞相比，G3 CAR-T细胞的治疗触发了重要细胞内信号分子（如LAT、ZAP-70、SYK和ERK）的更多磷酸化。因此，G3 CAR-T细胞产生更多的IL-2，具有更高的增殖能力和更好的体内持久性。
几项研究探索了4-1BB G3 CAR-T细胞的临床应用，在四名复发性惰性B细胞或套细胞淋巴瘤（MCL）患者中进行了一项小型试验，以测试针对靶向CD20的CD28和4-1BB G3CAR-T细胞的安全性，该试验证明其总体上安全且耐受性良好。值得注意的是，其中2名患者CR，并且在12个月和24个月内没有进展，即使在输注后1年，血液中也能检测到CAR-T细胞。此外，针对其他靶点的G3 CAR-T细胞也进行了评估。例如，前列腺癌靶抗原（PSMA）G3 CD28和4-1BB CAR-T细胞也显示出强大的抗肿瘤活性。
总之，在CAR-T细胞结构中加入4-1BB共刺激结构域可改善CAR-T细胞的体内持久性，增强记忆形成，并降低耗竭标记物的表达。在结合4-1BB和CD28共刺激的G3 CAR-T细胞构建中，与G2 CAR-T细胞相比，获得了更高的增殖能力和更好的体内持久性。并且迄今为止发现CD28和4-1BB G3 CAR-T细胞安全且耐受性良好。然而，考虑到CAR-T细胞应用中的某些共刺激结构域用于治疗特定类型的癌症，因此，在得出明确结论之前应小心谨慎。

OX40的共刺激结构域
另一个被探索作为CAR-T细胞共刺激剂的TNFRSF成员是OX40。OX40仅在MHC-TCR参与时在T细胞上上调，OX40信号增加T细胞的持久性并诱导记忆性T细胞（Tm）的形成。OX40信号还触发克隆扩增并上调抗凋亡蛋白的表达，如Bcl-2、Bcl-xL和Bfl-1，从而促进活化T细胞的存活。
OX40和4-1BB在功能上有许多相似之处，但它们在调节CD4+和CD8+T细胞反应方面存在明显的活性差异。OX40和4-1BB实际上在腺病毒感染时调节CD8+ T细胞克隆扩增方面具有相反的作用，OX40缺陷的CD8+T细胞显示CD8+T细胞扩增减少，而4-1BB缺陷的CD8+T细胞实际上表现出高反应性，导致CD8+T细胞数量增加。此外，T细胞分化为功能性效应细胞需要OX40，而4-1BB导致启动早期分化水平降低。
与CD28 G2 CAR-T相比，OX40G2 CAR-T细胞产生更多IFN-γ、同等水平的IL-2和类似的CAR-T细胞增殖反应。更重要的是，OX40 G2 CAR-T细胞产生的IL-10水平显著降低。相应地，与CD28 G2 CAR-T细胞相比，针对癌胚抗原（CEA）的G3 CAR-T细胞中CD28与OX40的联合刺激降低了IL-10的水平，并阻止了CAR-T细胞的自动抑制。此外，CD28/OX40共刺激使CAR-T细胞在重复抗原结合时免于激活诱导的细胞死亡。
许多早期证据表明OX40是一种很有希望用于CAR-T细胞的共刺激结构域。它能防止自身抑制，拯救活化诱导的细胞死亡，以及优越的细胞毒性活性。目前，靶向双唾液酸神经节苷脂（GD2）阳性实体癌（如黑色素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤和一些其他肉瘤）的CD28/OX40CAR-T细胞是正在治疗转移性黑色素瘤的临床试验（NCT02107963）中进行评估。

CD27的共刺激结构域
CD27的表达存在于CD4+和CD8+T细胞、NK细胞和启动的B细胞上。CD27的配体CD70在抗原呈递细胞上表达，包括DC和巨噬细胞。在激活T细胞上的CD27后，下游信号通过NF-κB诱导激活，导致T细胞活化、分化和克隆扩增。
与G1 CAR T细胞相比，在SKOV3人卵巢癌细胞-小鼠模型中，CD27 G2 CAR-T细胞具有增强的抗原刺激效应器功能、上调抗凋亡蛋白的表达、增强的体内持久性和增强的肿瘤消退。在该模型中，CD27 G2 CAR-T细胞和4-1BB或CD28 G2 CAR-T细胞之间未观察到差异。然而，与CD28介导的共刺激相比，CD27共刺激增强了CAR-T细胞的持久性。
临床上，在34例神经母细胞瘤患者中，以GD2为靶向的CD27/CD28 CAR-T细胞治疗产生15%的PR和38%的SD，一年生存率为74%。在另一项最近关于CD27/CD28 CAR-T细胞的临床研究中，CLL1靶向CAR-T细胞在AML患者中被证明是安全的。令人印象深刻的是，在这项研究的四名患者有3名显示CR，MRD阴性，可以继续进行造血干细胞移植（HSCT）。这些患者的副作用仅限于1至2级CRS。
值得注意的是，激活CD27也可诱导CD8+T细胞的终末分化、耗竭和凋亡。事实上，IL13Rα2靶向的G2 4-1BB CAR-T细胞表面组成性表达的CD27分子大大减少了CAR-T细胞的增殖，并诱导其耗竭和凋亡。
总之，CD27介导的共刺激可以增强不同的CAR-T细胞特征，如CAR-T细胞的持久性和细胞毒性。临床上，CD27/CD28共刺激组合在神经母细胞瘤、AML和淋巴瘤患者中产生了令人印象深刻的反应。然而，在CAR-T细胞结构中，CD27和其他共刺激分子的组合也应仔细考虑，以避免终末分化和耗竭。

CD40的共刺激结构域
CD40在髓源性抗原呈递细胞上表达，如树突状细胞（DC）、粒细胞和巨噬细胞。CD40配体（CD40L）主要在活化的T细胞和NK细胞上表达。在APC上，CD40与CD40L的结合激活抗原呈递和共刺激信号，从而促进细胞毒性T细胞的激活和扩增。
在最初的研究中，无论是G2型还是带有CD28结构域的G3型，CD40或4-1BB CAR-T细胞之间的抗原特异性靶细胞杀伤均未观察到差异。然而，与4-1BB共刺激相比，CD40共刺激确实触发了更强的NF-κB激活。
为了增强共刺激信号，CD40 CAR-T细胞已与CAR结构中的其他共刺激分子结合，例如与B细胞信号部分的CD79A结合，这两种受体都激活下游的NF-κB、NFAT和AP-1信号。与CD28或4-1BB共刺激的CAR-T细胞相比，CD79A/CD40CAR-T细胞在体外与CD19表达细胞共培养时，NF-κB和p38活性升高，增殖更多。在接种Raji肿瘤细胞的小鼠中，与CD28或4-1BB共刺激的CAR-T细胞相比，CD79A/CD40共刺激的CAR-T细胞也具有更好的抗肿瘤活性和增殖活性。

HEVM和GITR的共刺激结构域
HVEM和GITR最近也被纳入到CAR-T细胞结构中。HVEM具有免疫刺激和免疫抑制功能，并与配体CD160、BTLA、LIGHT和LTα相互作用。HVEM在各种免疫细胞上表达，包括T细胞、B细胞、NK细胞和树突状细胞。HVEM与LIGHT或LTα的结合导致T细胞活化和增殖，而HVEM与T细胞表达的BTLA的结合抑制T细胞活化。此外，HVEM还调节CD8+T细胞的效应器和记忆形成。
到目前为止，HVEM作为CAR-T细胞的共刺激结构域仅被报道过一次，与对照CD28或4-1BB G2 CAR-T细胞相比，HVEM G2 CAR-T细胞表现出增强的抗肿瘤细胞毒性和促炎细胞因子生成，例如IL-2、TNF-α和IFN-γ。此外，HVEMG2 CAR-T细胞中的CAR-T耗竭降低，并且检测到Tcm和Tem细胞的等效百分比。相比之下，在CD28和4-1BB CAR-T细胞中，Tem和Tcm亚群分别高度富集。因此，HVEM G2 CAR-T细胞似乎产生了更平衡的CAR-T细胞表型。有趣的是，在体外的HVEM CAR-T细胞中检测到糖酵解和线粒体呼吸水平增强。因此，HVEM共刺激似乎增加了能量代谢，这一特征与T细胞耗竭减少正相关。
CAR-T共刺激域的另一个TNFRSF成员是GITR。与4-1BB或OX40不同，GITR在T细胞上呈组成性表达，在CD4/CD25/Foxp3阳性Treg上的表达高于幼稚或记忆性T细胞。此外，在TCR激活后，效应T细胞上GITR的表达上调。GITR激动剂抑制Treg的抑制活性并提高效应T细胞的存活率。
在EGFR靶向的CAR-T细胞中，GITR共刺激产生的抗肿瘤活性与各种肿瘤细胞系中CD28或4-1BB G2 CAR-T细胞相当，甚至更强。靶向CD19的GITR G2 CAR-T细胞在体内也显著抑制了Raji肿瘤细胞的生长。此外，与共刺激CAR-T结构域DAP-10、CD28、4-1BB、ICOS和OX40相比，GITR共刺激在T细胞淋巴瘤和黑色素瘤模型体内表现出更强的细胞毒性。然而，与CD28 CAR-T细胞相比，GITR共刺激确实减少了TNF-α、IL-2和Th17相关细胞因子的分泌，并诱导了更分化的效应器表型，同时降低了体内持久性。

总结与展望
在CAR-T细胞中添加的各种TNFRSF成员的共刺激域中，不同的TNFRSF成员之间具有明显优势和劣势。显然，通过选择和/或组合不同的共刺激域，可以极大地影响和驱动CAR-T细胞的效果。
在这方面，在最近的比较中，临床产品中通常使用的CD28和4-1BB共刺激结构域明显优于其它共刺激结构域，包括OX40、ICOS或CD27。因此，进一步工程化CAR-T细胞的细胞内结构域可能产生增强的功能。例如，OX40共刺激结构域类似于4-1BB，可用于增强CAR-T细胞的持久性，但与CD28共刺激结构域相比，其对效应器功能的激活减少。GITR共刺激结构域可用于驱动效应器功能，但与CD28一样，与持久性降低有关。此外，在激发持久的抗癌反应方面，OX40共刺激被证明优于4-1BB共刺激，而CD40 CAR-T细胞似乎对内源性免疫也有强烈的刺激作用。
特别是，G3或G4 CAR-T细胞中不同共刺激结构域的组合可能产生额外的临床益处，因为不同的CAR-T细胞功能可以组合以产生协同活性。例如，通过结合CD28和OX40共刺激结构域，早期效应器表型与持久性和持久性抗肿瘤反应相结合，优于CD28/4-1BB结合的CAR-T细胞。在另一种G3 CAR-T细胞方法中，CD28分别结合4-1BB和CD40的共刺激，后者显示出最有效的共刺激效应。

此外，除了确定要选择CAR-T细胞结构中TNFRSF家族的哪个成员外，还应注意ICD结构域的顺序、要选择哪个跨膜结构域以及铰链/间隔区的设计。共刺激域在CAR结构中的定位可以极大地影响CAR-T细胞的功能，并决定是否可以从共刺激域获得额外的益处。
最后，还要考虑TME的影响。最近的研究表明，用环磷酰胺预处理可有效地修饰免疫抑制性TME，从而在转移性前列腺癌和胰腺癌模型中产生靶向PSCA的4-1BB CAR-T细胞的持久治疗反应。此外，调节CAR-T也可能有助于修饰TME，OX40 G2 CAR-T细胞产生的抗炎分子IL-10水平明显低于CD28 G2 CAR-T细胞。与CD28 G2 CAR-T细胞相比，G3 CAR-T细胞中的CD28联合OX40刺激也降低了IL-10水平，并阻止了CAR-T细胞的自动抑制。因此，CD28和OX40联合刺激可能适用于靶向免疫抑制TME的CAR-T细胞。
不同TNFRSF成员的不同作用仍在探索中，我们对这一独特家族的理解可能还存在差距。尽管如此，这些成员的全部潜力被释放只是时间问题，无论是单独还是与其他TNFRSF成员联合使用。很明显毫无疑问，在下一代CAR-T细胞中，TNFRSF成员将继续发挥核心、多样和重要的作用。

       文章来源：健康界

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