技术应用--杆状病毒/昆虫细胞表达系统在生物制药中的应用

01
 
  Bac-to-Bac系统简介
       杆状病毒-昆虫细胞系统是一个由两个部分组成的二元系统。第一个部分就是杆状病毒表达载体，它是一个昆虫病毒，其功能显然就是将编码目标蛋白质的外源基因导人宿主细胞中。杆状病毒表达载体的另一个功能是为在晚期或极晚期启动子控制下的目标基因的转录提供所需的转录复合物。第二个部分就是宿主，通常是鳞翅类昆虫细胞系，但有时是鳞翅类的昆虫。
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注：（图，选自网络）重组杆状病毒的产生过程
      1983年，Smith首次在AcMNPV多角体启动子下成功克隆并表达了人的β-干扰素。同一时间，Hooft等报道了多角体基因的核苷酸序列。并且Pennock印证了产生重组病毒的方法，并通过分选出的重组病毒表达多角体蛋白-β-半乳糖苷酶的融合蛋白。随后，杆状病毒表达载体系统（baculovirus expression vector system，BEVS）开始在昆虫中表达目的蛋白。随着对杆状病毒上启动子的研究越来越透彻，发现杆状病毒启动子能够单独或与多角体蛋白启动子联合表达单个或多个外源蛋白。这个发现也为后来杆状病毒表达载体的发展提供了很重要的基础。在这个过程中研究者们定位了AcMNPV高效表达基因p10并测得其序列，之后构建了用p10启动子表达外源蛋白的AcMNPV。1988年Vlak等证明p10是非必须基因，并且在p10的位点上用p10启动子表达了β-半乳糖苷酶的融合蛋白。
     1990年Kitts等人发现线性化的杆状病毒DNA能提高得到重组载体的效率（~25-30%）。1993年Kitts和Posses分别在野生型杆状病毒多角体蛋白基因的相邻基因ORF603上游和ORF1629下游插入了一个不常见的限制性酶切点位Bsu36I。用限制性内切酶Bsu36I切割后的AcMNPV DNA只有与外源基因重组后，才能够感染细胞。改造后的杆状病毒表达载体与带有外源基因的载体重组率达到了90%，这大大提高了重组病毒的筛选效率。随后，Luckow等人优化了这个系统，他们对AcMNPV DNA进行了改造，在多角体基因位点插入了大肠杆菌的mini-F复制子、卡那霉素抗性基因和细菌转座子att-Tn7。新的杆状病毒穿梭载体（AcMNPV bacmid）既能向像质粒一样在大肠杆菌中进行复制，也能感染鳞翅目的昆虫细胞。重组的杆状病毒DNA先从大肠杆菌中纯化出来，然后转染到昆虫细胞产生重组杆状病毒，这就是Bac-to-Bac系统。直到2003年，Ian Jones敲除了ORF1629的部分序列，使杆状病毒重组效率达到100%。


02
杆状病毒载体的优势
   （1）易于操作。杆状病毒基因组较小，分子生物学特性比较简单，并且基因组上有多种限制性内切酶酶切位点。

   （2）容纳的外源基因大。杆状病毒的病毒粒子是杆状的，容纳外源基因可塑性比较强，理论上它能容纳任何外源基因。

   （3）能高效表达外源基因。在杆状病毒基因中p10基因和多角体蛋白基因都是极晚期基因，它们的启动子能够高效表达目的蛋白。

   （4）能对目的蛋白进行表达后修饰。杆状病毒的宿主为昆虫细胞，目的蛋白可以利用昆虫细胞的翻译后修饰系统进行加工和修饰。

   （5）安全性高。杆状病毒表达载体特异性非常强，只能够在昆虫细胞中进行复制。

   （6）成本低。与哺乳动物细胞比较，昆虫培养细胞系相对更易于生长，并且昆虫细胞能悬浮培养可大量生产目的蛋白。

03
杆状病毒-昆虫细胞表达系统设计
   （1）以目的基因序列翻译的蛋白序列为源模板，通过密码子优化一套更适宜SF9细胞系的基因序列。
   （2）根据目的基因序列分析结果，看目的基因是否含有信号肽，若无信号肽，在基因重组时需要在蛋白序列N端添加GP67信号序列帮助蛋白穿膜分泌表达至胞外，并且在C端添加6XHis-Tag便于重组蛋白的检测和亲和纯化。
依据上述设计思路，以基因合成的方式构建pFast-bac1-target-gene表达质粒，转化后通过蓝白筛选方法获得重组的Bacmid，经PCR鉴定之后转染sf9细胞，以获得P1代病毒和P2代病毒。侵染200ml小试表达，通过western blot检测蛋白表达情况，确认蛋白表达情况，再通过Ni Focurose 6FF(TED)亲和纯化获得80%以上纯度的目的蛋白。


04
实验方法
   1.pFast-bac1-XXX质粒构建
采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成target-gene基因，双酶切连接至pFast-bac1载体的BamH I和Hind III之间；将获得的重组质粒转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序。测序拼接序列与理论序列相比对，结果显示获得序列与理论序列100%匹配，在开始下面工作。
   2. 重组杆状病毒表达载体（Bacmid，杆粒）的构建
   2.1 杆粒菌株转化
   (1)DH10Bac E.coli 感受态细胞冰上解冻；
   (2)将200ng的pFastBac1-gene转移载体缓慢加入感受态细胞中，轻轻混匀；
   (3)冰上放置30min，然后42℃热击90s；
   (4)迅速冰上静止5min；
   (5)向EP管里加入900 μl S.O.C.培养基；
   (6)37℃，225 rpm震荡摇菌4h；
   (7)取100μl菌液涂于含有50 mg/ml 卡那霉素，7 mg/ml  庆大霉素，10 mg/ml  四环素，100 mg/ml x-gal,and 40 mg/ml IPTG的LB平板；
   (8)37℃，倒置培养48h。
   2.2 重组Bacmid质粒的鉴定
   挑取3个白色单克隆菌落接种分别接种于5ml含有50 mg/ml卡那霉素，7 mg/ml  庆大霉素，10 mg/ml  四环素，摇菌，菌液PCR初步筛选阳性克隆菌。小量抽取质粒，PCR验证杆粒正确性，因杆粒大小>135Kb，酶切方式很难进行验证，故采用PCR进行验证，理论上，若目的基因成功转座至Bacmid中，那扩增产物的大小应为（2300bp+目的基因长度）

   3.转染及收获病毒
    3.1 sf9细胞的培养
    sf9细胞培养使用SF 900Ⅱ培养基培养，一般每3天分瓶传代一次。处于对数生长期细胞且细胞活力大于95%的sf9  细胞用于转染实验。
    3.2 Sf9细胞冻存方法：
   细胞培养至对数生长期，活力超过90%;  计数，使得储存浓度为1×107 /ml至2×107 /ml;  准备所需量的储存培养液，加DMSO至10%和FBS至30%，预冷培养液保存于4℃; 离心悬浮细胞或单层细胞 100×g，5min，用预冷的冻存液悬浮至所需密度; 混匀，分装至冻存管; 将冻存管放入填有脱脂棉的泡沫盒，-80℃放置1天；移入液氮罐中保存。
   3.3  Bacmid转染sf9细胞
    (1)在六孔板中接种9×105个细胞/2ml/孔。其中培养基Grace’s medium中含有青霉素50U/ml，链霉素50ug/ml，10％FBS；
   (2) 27℃培养1h，使细胞贴壁; 
   (3) 在这期间制备Bacmid与Cellfectin Reagent复合物：A.  用100ul不完全Grace’s medium（不含双抗、FBS）稀释1ug Bacmid（约5ul）; B.  在使用前将Cellfectin Reagent倒置5~10次，使其充分混匀，取6ul Cellfectin Reagent用100ul不完全Grace’s medium（不含双抗、FBS）稀释; C.  将上述两种稀释液合并（总体积约210ul），轻轻混匀，室温孵育15~45min; 
   (4)  在制备Bacmid与Cellfectin Reagent复合物期间，将六孔板中的培养基吸掉，用2ml不完全Grace’s medium（不含双抗、FBS）洗涤一次，去掉培养基; 
   (5) 在含有210ul的复合物的管内加入800ul的不完全Graces medium（不含双抗、FBS），轻轻混匀，加到每个孔中;
   (6) 将六孔板内的细胞孵育5h，27℃；
   (7) 去掉复合物混合液，然后在每个孔中加2ml完全培养基（SF900含双抗、10％FBS）；
   (8) 在27℃湿度培养箱中孵育72h或着直到细胞出现病毒感染迹象。上清和沉淀需要分别制备样品，待后期western blot表达鉴定使用。
   4.  P1病毒液的收集
    当细胞出现感染迹象时，将细胞上清转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min以去除细胞及大的碎片，可用蛋白结合率低的0.2um的滤膜过滤，滴度损失小于10%；将含病毒的上清液转移到另一个无菌带盖的EP管中（一般，P1的滴度在10^6pfu/ml左右）, 将得到的病毒液体避光置于4℃冰箱（短期）。若长期保存，进行1ml分装，避光储存于-80℃。

   5.  P2病毒扩增及收获
    原代病毒滴度(P1)较低，介于1×106~1×107，扩增后滴度为1×107~1×108。50ml摇瓶中加入适量的P1病毒.
    扩增病毒时可用下列公式进行计算：
    MOI(Multiplicity of infection)在0.01~0.1之间,
    接种量 （ml）:desired MOI (phf/ml) ×(total number of cells) tlter of viral inoculum (puf/ml) 感染细胞48 h收集的病毒扩增的将近100倍，超过48h 收集的病毒质量较低。每种病毒的收集时间都有一定的差别，如在72h收集，但是随着细胞的裂解，病毒的增殖活力会受损。

   6.  病毒滴度检测
   六孔板中细胞120万/孔，静置培养1h，病毒梯度稀释101 102 103 104 105 106 107 108 ，去掉六孔板中的上清，取106、107、108三个滴度病毒加入到六孔板中，平行对照2组，孵育1h，配置空斑培养基，每孔加入2mL空斑培养基；第四天加入中性红染色液；7-10天计数空斑数，算病毒滴度

   7. 重组蛋白表达纯化
   sf9细胞以2×106/ml瓶接种于500ml细胞培养瓶中；待细胞生长至对数期，接P2代病毒感染sf9细胞；48~72h内收集细胞及上清，用于重组蛋白表达的检测。
 7.1、依此条件方法放大培养。4℃ 10000g离心20 min，取上清；
 7.2. 利用低压层析系统，上清液以0.5 ml/min流速上样至Ni Focurose 6FF(TED)  Binding-Buffer预平衡的Ni Fcourose 6FF(TED)亲和层析柱；
 7.3. 用Ni Focurose 6FF(TED)Binding-Buffer以0.5 ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；
 7.4. 用Ni Focurose 6FF(TED) Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl，20 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；
 7.55. 用Ni Focurose 6FF(TED) Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl，250 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；
 7.6.将上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS（PH7.4）进行透析过夜；
 7.7. 进行10% SDS-PAGE分析,
   8.  Western Blot检测
 8.1. 样品上样0.01ug。
 8.2. 上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束。
 8.3. 电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜，约为1.5小时。
 8.4. 电转结束后，取下膜后先用PBS洗涤4次，每次5分钟。然后置于5%脱脂奶粉封闭液中封闭37℃ 1小时。
 8.5. 用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中37℃反应1小时。
 8.6. 洗膜4次，每次5 分钟；用含5%牛奶的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1小时。
 8.7. 洗膜ECL显影。

       文章来源：允咨生物GMP学苑

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