【干货】凝胶过滤层析常见问题解析

色谱峰对称性差
出峰上升时，上升缓慢是填料装填过紧，而拖尾是因为装填的太松，此时对称因子及柱效都很差，出现这种情况就要重现装柱。装柱前要了解填料的压缩系数（压缩因子）如Focurose FF系列的填料的压缩系数是1.15，且装完后要测柱效。
柱床有裂缝或干涸等塌柱现象
检测管路及柱床体系是否有泄露或气泡，必要时重新装柱。
分离度差

样品和选择的填料不匹配
待分离的样品中目标物质和其它杂质的分子量小于2倍且都在选择的填料的排阻极限之外或者之内。若样品中目标物质的分子量和其它杂质的分子量小于2倍时，建议尝试其它方法分离，反之选择凝胶过滤层析时，填料的选择应根据样品中目标分子的大小选择最接近（大或小都可以）目标分子排阻极限的填料进行分离。

柱床装填的效果差
通过测柱效等方式确保柱床装填的满足凝胶过滤层析的过程。

上样量过大
根据样品中目标物质和杂质的分子差异优化上样量，如脱盐等样品中目标分子和杂质的分子量大于50倍时，上样量可以达到柱床体积的25%，最高不超过30%，若样品中目标分子和杂质的分子量差异在2-5倍时，通常上样量控制在柱床体积的5%以内。

流速过快
凝胶过滤的过程流速不宜过快，降低流速在一定程度上可以提高分离度。

层析填料被污染或老化
随着填料的使用，一些杂质的积累会使层析填料的孔径发生变化（如堵塞，非特异性吸附积累，微生物污染，破碎等），导致其排阻能力发生偏差而影响分离度。此时可对填料进行CIP清洗，若清洗后还不能达到分离要求，就要更换新的填料。

样品自身的问题
样品粘度过大也会导致分离度下降，粘度大的样品在凝胶过滤时要对其进行稀释处理在凝胶过滤；
样品中目标物质和其它杂质的非特异性结合或者作用力，此时就要尝试添加一些添加剂（如2%的Triton x-100,150mM NaCl等），减少样品中各组份之间的作用力；
样品的pH，离子强度对某些填料的柱床体积会产生一些影响，也会影响分离度，必要时可以优化样品的缓冲液。
反压大，液流慢
凝胶过滤层析柱的装填应控制在60-100cm，太低影响分离度，太高反压增大。另外填料的清洁程度及样品的粘度，pH，离子强度也会影响液流速度。

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       文章来源：允咨生物GMP学苑

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