检验分析方法的验证和确认(2)

检测限系指供试品中被测物能被检测出的最低量。

a. 非仪器分析目视法

通过对一系列含有已知浓度分析物的样品进行分析，以确定能够被可靠测定的分析物的最低浓度。

 b. 仪器法（信噪比法）

该方法仅适用于出现基线噪音的分析方法。信噪比的确定是通过比较含已知低浓度被分析物样品与空白样品的测试信号，确定被分析物可以靠被检测到的最小浓度。通常信噪比为3：1或2：1时，检测限可以被接受。

检测限系指供试品中被测物能被检测出的最低量。

c. 响应值的标准差和斜率

检测限（DL）可以表达为：DL=3.3σ /S式中，σ为响应值的标准差；S为校正曲线的斜率。

斜率s可从被分析物的校正曲线来估算，而σ值可由多种途径估算。例如：基于空白的标准差；基于校正曲线。

数据要求：

（1）应当提供检测限和测定检测限的方法。

（2）如果方法采用目测法和信噪比法，应提供测试图谱。

（3）如果通过计算或外推法得到检测限的估算值，可对一系列或等于检测限样品的独立分析来验证这一估算值。

定量限（Limit of Quantitative, LOQ）

定义：定量限系指供试品中被测成分能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降解产物用定量测定方法研究时，应确定定量限。 

试验方法：

（1）目测法

（2）信噪比法：以信噪比10:1时的浓度（或量）进样测定,重复测定的响应值应满足精密度要求。

（3）基于响应值的标准差和斜率

耐用性

定义：耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。

1. 耐用性进行评估应当在研制阶段就加以考虑，它取决于所研究的分析方法类型。应表明在对方法参数进行有意改变后，分析方法依然可靠

2. 如果测定的结果表明该方法对分析条件的变化是敏感的，那么这些分析条件就应适当地加以控制或在方法中预先提出告诫。因此应当对耐用性进行评估，并建立一系列的系统适用性参数（如分离度实验），以确保该分析方法在任何时候都可以保持有效性。

3. 如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明。

考察因素：分析溶液的稳定性；样品的提取次数、时间；液相色谱方法；流动相pH值变化的影响；流动相组分变化的影响；不同色谱柱（和／或供应商）；温度； 流速。

气相色谱方法：不同色谱柱（不同的批号和／或供应商）；温度；流速；固定相；不同类型的载体 。

薄层色谱法：不同品牌的薄层板；点样方式；薄层展开时温度及相对湿度的变化。

试验示例--不同柱温比较 

系统适用性实验是许多分析方法的组成部分，这些实验的基本概念是要把由分析设备、电子仪器、实验操作和被分析样品所组成的完整系统进行整体评估。对于特定方法的系统适应性参数的建立依赖于被验证方法的类型。进一步信息可参考药典。

验证检测项目小结

1. 鉴别

鉴别的目的在于判定被分析物是目标化合物，而非其它物质，用于鉴别的分析方法要求具有较强的专属性。

2. 杂质检查（限度试验、定量试验）

杂质检查主要用于控制主成分以外的杂质，如有机杂质、无机杂质等。

杂质检查要准确反应供试品的纯度特性，可分为限度试验和定量试验两种情况。用于限度试验的分析方法验证侧重专属性和检测限。用于定量试验的分析方法验证强调专属性、准确度和定量限。 

3. 定量测定

定量测定包括含量测定、制剂的溶出度（释放度）测定等，由于此类项目对准确性要求较高，故所采用的分析方法要求具有一定的专属性、准确度和线性。

4. 其他特定检测项目

其他特定检测项目包括粒径分布、旋光度、分子量分布等，由于这些检测项目的要求与鉴别、杂质检查、定量测定等有所不同，对于这些项目的分析方法验证应有不同的要求。

需验证项目

注意：-表示通常不需要做的项目；+表示通常需要做的项目。

①假如已做了重现性（见术语表），就不需再做中间精密度。

②分析方法缺乏专属性，可以由其他分析方法来补充。

③有些情况下可能需要。

分析方法验证的方式和步骤

分析方法应给出完成每个分析试验所需的详细步骤。

（1）可能包括供试品、对照品和试剂的配制和制备；

（2）仪器的使用说明；

（3）标准曲线的绘制；

（4）计算公式的使用等信息，

当然，分析方法的内容不仅限于上述信息。

在实际工作中，可以对实验工作进行充分的设计，使得可以同时考察多个适当的验证项目，提供分析方法科学的、综合的能力情况，比如：专属性、线性、范围、准确度和精密度等。

分析方法验证常见问题

药味的选择问题：

（1）供试品溶液制备考察不全面 

（2）对照品溶液浓度与供试品不匹配

（3）标准曲线的制备  样品测定不在线性范围之内取样、范围太小、单位等问题

（4）色谱条件的选择  应详述理由并附相关图谱

（5）方法改变后应与原方法作比较

（6）对照品溶液的制备  对照品称量难以达到精密称定的要求

（7）回收率测定问题

耐用性考察问题：

（1）特殊剂型如分散片建议研究建立主要成分的溶出度检查方法 ，限度的制定有时不能照搬二部药典。

（2）单味制剂，应作辅料空白样品，进行空白对照试验。

（3）正文，不规范。

三、分析方法确认

1. 分析方法确认：

 一个阐述通过已验证方法进行产品测试的条件确实适合于该验证方法的过程。

2. 适用范围：

物料和产品中不需要进行验证的检验方法以及药典方法和其他已验证的法定标准。通过方法确认来证明在本实验室条件下的适用性。

3. 不适用于：

日常检验一般理化方法。如干燥失重、炽灼残渣；分析方法的验证通常在产品的研发阶段已经进行； 应关注不同实验室之间方法转移时的确认。

采用药典规定的检验方法需要确认的目的：

（1）在于提供第一次使用实验室的人员、设备和试剂进行法定分析方法确认时得到可接受结果的基本信息。

（2）确认包括所选择的方法性能参数，如那些在USP<1225>中描述的，是产生相关数据而不是重复验证过程。

（3）方法使用者应有相当的经验、知识并经过培训能够按照书面的法定方法进行操作。由使用者进行方法确认可以提供法定方法能够适合相应的测试目的的信心。

（4）尽管缺认法定方法在真实条件下使用时的适应性不需要进行完整的再验证过程，列在<1225>表2中的一些分析参数可以在确认过程中使用。特定方法的确认仅需要对被认为适宜的参数进行评估。

<1226>法定方法确认：

除非有迹象显示法定方法不适应各论下测试要求，一些基本的常规方法不需要做验证。基本法定分析方法包括但不限于：干燥失重、炽灼残渣、各种化学检测如酸度检测，简单的仪器分析如用pH值测试仪测定pH值。药典建议，对于首次使用药典方法进行常规检测的实验，应考虑到任何新的或不同的样品或溶液的处理要求。