生物反应器传感器：一次性系统和连续生产

生物制造类似于一个“黑匣子”，测量 pH 值、葡萄糖水平甚至细胞密度等关键参数的工作传统上需要对生物反应器的内容物进行取样。该操作会使工艺和操作员都面临污染风险。传感器技术的新发展旨在应对其中一些挑战，但一次性技术的快速行业采用带来了一些障碍。一些生物反应器罐和一次性内衬袋在使用前进行灭菌，并在一批培养后进行处理。因此内部传感器必须能够承受伽马辐照灭菌。它们还必须设计成适合不同生物反应器设计的工程配置。

生物工艺技术供应商必须努力跟上这种趋势。尽管各公司尚未对其当前的生物反应器罐做出重大改变，但它正在分析这些趋势，同时致力于下一代设计和产品线扩展。尽管如此，预测当新设计投入生产和销售时哪些传感器技术最相关仍然很困难。 Cytiva 细胞生长平台负责人 Carrie Miller 表示：“行业有责任确保新技术得到验证，能够在常规基础上发挥作用，并且是可持续的。”
一次性系统还加速了另一个趋势：采用连续或灌流生产，其中生产是持续进行的，而不是逐批进行。该方法可以减少工艺时间和运营成本，同时提高产品一致性。 “您不必担心更换现有的不锈钢基础设施。您可以立即使用灌流生物反应器的一次性形式，”Entegris 生命科学全球和商业开发总监 Todd Kapp 说。灌流生产也增加了对生物传感器的需求，因为必须仔细监控系统，以便过程控制设备能够对性能偏差做出反应。

一次性系统中的嵌入式传感器
2019 年一次性生物反应器的销售额超过了传统不锈钢生物反应器，并且在 COVID-19 大流行期间这一趋势进一步加速。研究人员和制造商已转向一次性系统来生产和测试 SARS-CoV-2 候选疫苗，因为此类技术灵活且设置迅速。 “一次性技术的实施刚刚爆炸式增长。这不再是人们何时采用它的问题，而是他们会更多地使用它，”Kapp说。
生物反应器传感器的设计必须适应这一趋势。对于传统的不锈钢生物反应器，最终用户必须校准和维护传感器，但一次性传感器可能需要自行校准。 “你把责任推给了供应商，”Bradley James Corporation 的首席技术专家 CD Feng 说。这是因为嵌入式传感器必须与一次性袋子本身一起消毒，因此最终用户没有机会对其进行安全校准。这可能会导致一个更隐蔽的问题：一次性生物传感器必须从一个传感器到另一个传感器产生可重复的结果。 “当一次性传感器干燥存放时，可能会发生漂移。大多数人真的没有研究过这个问题，”Feng说。
这种不确定性还会导致生物制造商质疑嵌入式传感器的准确性。 “人们仍然对此感到紧张。公司总是会进行离线测量，以确认他们在入线系统中看到的结果。我认为他们不太愿意依赖在线测量. 但随着连续生产的发展，他们将别无选择，只能这样做。你将无法足够快地采样并在出现问题时进行更正，”Kapp 解释道。离线测量需要从罐中取出样品并在外部进行分析。入线传感器连续测量参数。传感器可以与培养基（或其它物质）直接接触或通过玻璃窗与培养基隔开。离线采样需要将样本带到实验室，这可能会导致结果延迟很长时间。该方法不能用于过程控制。

监测和控制
传感器用于优化生产过程中的细胞生长条件，并确保工艺顺利进行。生物制造商需要知道表达治疗性蛋白质或抗原的细胞状态（用于疫苗开发）。有关营养水平、酸度 (pH)、溶解氧 (DO) 和其它参数的信息可以标记干预或在出现问题时通知操作员调查错误。
一般来说，传感器技术要么是电化学的，要么是光学的。电化学传感器依赖于与过程流体的直接接触，并记录由于分析物的直接或间接作用而产生的电流变化。这些变化与物质的浓度相关。即使对于传统的生物反应器，这种直接接触也是一个问题。所有与生物工艺流体的接触都会增加污染风险。接触培养基的一次性传感器与生物反应器或袋子一起灭菌，以最大限度地降低污染风险。生物反应器或袋子设计者可能还需要合并可用于将样品输送到传感器的闭合循环回路。相比之下，光学传感器分析分子对透射光的影响，并可以通过透明膜“观察”来防止污染和采样问题。
Feng说，监测 pH 值的传感器是最常见的。生物工艺通常在 pH 7.0 下进行。但是，当传感器干燥存放时，有几个因素会导致漂移，包括传感玻璃和传感器参考物的再水化。
培养酸度是最重要的控制参数之一，因为它对细胞生长和产品产量有重大影响。但是如何监控此参数也引发了对信任传感器测量结果的担忧。基于玻璃电极的 pH 传感器是生物制造领域的标准配置，但由于 pH 是一个常规值，因此必须根据可追溯的标准溶液对其进行验证。因此，通常使用标准溶液直接或间接检查 pH 值。 Feng 表示，许多生物制药制造商发现 pH 值仅 0.1 的漂移就可能导致数百万美元的产量损失。
这种漂移的来源长期以来一直是个谜。但在与 Genentech 的合作中，Feng 的团队并未将漂移追踪到参考标准（长期以来一直怀疑），而是追踪到传感玻璃和传感器在用于对其进行灭菌的高压灭菌过程中所承受的条件。为了解决这个问题，Feng 通过将灯泡结构转换为共面设计，创造了一种新型 pH 传感器。这使得传感表面/区域从一个腔室转移到另一个腔室而不改变两个空间之间的隔离。因此 pH 传感器有自己的校准室。共面传感器在室内校准后，pH 传感玻璃可以通过 O 形密封圈进行测量。必要时，可以将传感部件“拉回”校准室以重新检查其校准。
葡萄糖水平是细胞培养过程中的另一个重要参数。葡萄糖是动物细胞的主要能量来源。许多细胞途径结合起来调节能量代谢，并且都对生物反应器内的条件做出反应。已经开发出用于测量葡萄糖的传感器，其中一些传感器基于糖尿病患者的血液监测设备，但它们尚未被用于生物制造。这部分是因为医疗应用不需要对葡萄糖传感器进行灭菌（首先从患者身上抽血）。这个技术难题需要克服。
为一次性系统调整传感器仍然具有挑战性。压力传感器等更简单的设备已经很好地适应了一次性应用，但浊度传感器却落后了。它们需要进行校准，以便它们可以更好地检测。 “它们在离线状态下工作得很好，但在入线状态下就不太好了，”Kapp 说。他指出超声波流量传感器已经改进。 “随着我们从批次工艺转向灌流和连续工艺，我们需要持续观察料液流动情况的能力。这是一个新的市场领域，对流通式传感器产生了更多需求，”他说。这种需求来自于流体从一个工艺过程流向另一个过程时施加在管子上的压力，例如将培养基转移到生物反应器中。
光学传感器可用于最大限度地减少污染和提取问题，因为它们通过透明膜进行检测。紫外线 (UV) 光检测器已使用多年，尤其是在纯化步骤中，用于发现蛋白质穿透。但它们无法追踪分析物的浓度，这在测量产品形成和其它参数时会很有帮助。 UV 检测器已经取得了一些进展，该检测器可以跨多个波长拾取信号，从而比检测单个波长时具有更高的准确性和可靠性。
另一种有前途的评估方法使用折射率 (loR)，尽管该技术处于相对早期的研究阶段。该方法包括测量光线离开一种介质并进入另一种介质时的弯曲程度。
该测量取决于溶液的浓度，因此可用于分析浓度变化和/或杂质。 “IoR 不需要设置光程来获得准确的测量值。与 UV 检测不同，IoR 技术不受溶液中固体的影响。这是一个重要的区别，尤其是当操作员有机会对早期工艺进行修改、防止产品损失时。” IoR 长期以来一直用于小分子制药工艺，也是一种新的生物工艺方法，但尚未适应一次性系统。
其它传感器测量目标分子的光吸收（紫外线或近红外线）。用于拉曼光谱的传感器寻找照明激光发出的光的明显散射。与其它光谱方法一样，此类传感器可以同时检测多个生物分子。 “[拉曼方法] 非常强大，因为它非常通用。你可以用它来观察任何东西的数量，尤其是与客户相关的特定化学品。但它也非常复杂，因为你需要统计软件包，以支持拉曼数据的分析，所有数据线都很复杂，”Culture Biosciences 的高级系统工程师 Helen Luo 说。另一个问题是拉曼光谱可能会被荧光淹没，这是生物制造介质中存在的某些生物分子中发现的一种特性。

用于连续生产的传感器
操作员在工艺开发过程中使用传感器来表征他们的生物工艺并优化效率、产量和产品一致性。这一点尤其重要，因为一些制造商考虑从批次生产转向连续生产，这涉及连续注入新鲜培养基并清除废物。连续生产依赖于稳定的细胞系和生物反应器条件，这些条件可以支持高活细胞密度。批次生产已成为常态，但连续策略有可能提高生产效率并降低运营成本。
连续生产还需要传感器来指示何时添加新鲜培养基。传统上，该决定是通过提取样品并测量葡萄糖、乳酸、氨、产物分泌率、细胞计数和其它参数来做出的。但这可能会阻碍保持系统最佳运行的努力，从而产生对在线传感器的需求。
连续细胞培养也增加了对过程分析技术 (PAT) 的需求，因为与批次生产相比，生物制造的所有要素都更加紧密地集成在一起。对于连续生产，操作员必须确保单元操作之间的适当流量，并且在过程性能偏离时应自动调整操作参数。工艺开发人员实施 PAT 以创建稳定、长寿命的系统。这需要能够在 0.1 mL 至 100 mL 规模的微型生物反应器中运行的传感器。但很少有实时传感器可以在该范围内运行。
创新：新传感器设计的进展仍在继续。一些传感器可以完全封闭在生物反应器内，通过蓝牙或其它无线路由发送信号。这种设计受到小型化的限制。一种名为 PATsule 传感器胶囊的设备由爱尔兰国家生物工艺研究与培训研究所和Tyndall国家研究所合作开发，大约有四分之一硬币那么大，可以自由漂浮，收集和传输 pH 值和溶氧数据。丹麦公司 Freesense 也开发了球形传感器，可以测量 pH 值、温度、压力、电导率和浊度。它们有一个可消毒的外壳，其中包含电子板、电池和传感元件。除了提供实时数据收集外，球体还可以在反应器内沿梯度生成空间信息。
并非所有公司都有能力进行大量工艺开发。由于多个高优先级项目，其它公司的产能有限。Culture Biosciences 为他们提供了基于云的服务，其中包含台式一次性生物反应器。客户可以同时运行多个实验，实时改变条件，每两分钟从 DO、CO2、pH 和其它传感器获取基于网络的更新。该公司还在每个生物反应器上提供废气传感器，这些传感器相对昂贵，因此通常不会在工艺开发的早期阶段使用。 Luo 解释说：“我们认为它们对于过程理解绝对至关重要。那是因为这是您获取在线、时间分辨的代谢信息的唯一途径。否则，您可能会错过过程中的瞬态行为。在我们的许多客户运行中，我们看到 O2 需求和 CO2 输出的突然变化，您有时可能会在 DO 和 pH 曲线中错过这些变化，因为它们受到主动控制。
这些信息可以帮助扩大规模，甚至可以帮助选择使用哪种微生物菌株作为生产底物。例如，如果测试菌株没有按预期消耗培养基成分，它可能不是一个好的候选者。 “它可以帮助您了解正在发生的新陈代谢变化。然后，当一种菌株的代谢行为与另一种不同时，您可以非常快速地查明，而无需运行额外的实验或进行过多的离线采样。这可以让你很快排除某些菌株，”Luo说。

软传感器
一些传感器超越了数据收集。软传感器将软件与传感器相结合，使用算法生成有关过程状态的信息，这些信息未反映在测量本身中。程序可以解释光谱信号以确定分析物的浓度，或结合温度、压力和 pH 值等测量值来模拟生物反应器容器的当前状态。
软传感器用于在线测量，包括温度、压力、pH 值、浊度、光谱和废气分析。传感器软件将信号转换为特定值。潜在的应用包括估计生物量浓度，这可以提高生产的可重复性。软传感器还可以监控培养基成分。事实上，任何通常在工艺完成后离线测量的过程都可以在生产过程中通过软传感器进行建模。一旦创建了模型，以后离线测量的任何值都可以使用软传感器在线测量。然后可以将用于创建模型的参数与软传感器收集的实时值进行比较。公司通常使用制造执行系统 (MES) 来控制过程。
软传感器通常在生产过程中用于实时监控关键变量，这是质量源于设计 (QbD) 的关键组成部分。它们还可以在工艺开发过程中使用，为连续工艺建立模型，例如，结合生物质浓度以确保运行之间的细胞密度相似，这应该会提高可重现性。
软传感器的一个风险是，大量的数据和分析可能导致过程化学家混淆相关性和因果关系，从而对真正的过程理解以及数据如何与之相关产生影响。
与传统传感器一样，软传感器需要适应一次性应用。 “我不认为一次性技术市场上有太多人在谈论它，但使用人工智能在线分析会在理解这些过程方面产生很大的不同，”Kapp说。


原文：J.Kling, Bioreactor sensors inside the dynamics of cell culture, Bioprocess International eBook, 2022.

       文章来源： 生物工艺与技术

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