关于杂质限度测定，定量测定及限度检查的验证要求

中国药典对于杂质的限度检测验证的要求包括专属性，检测限和耐用性，相比较之前的鉴别测试的专属性及耐用性，多了一个检测限的要求。

同时，由于杂质的限度测试中，杂质的含量比例相对鉴别试验是比较低的，所以在专属性和耐用性方面的要求略有不同。

对于专属性而言，杂质的限度测定最靠谱的方法毫无疑问是色谱法，在杂质可获得的情况下，可以向试样中加入一定量的杂质，重点考察杂质与主成分之间的分离度和检出水平，同时，这种方法应该可以保证一定的准确度和精密度，尤其是准确度，中国药典尽管没有要求，但是USP中对于杂质限度测试的准确度的要求是视具体情况而定。

杂质或降低产物不可获得的情况下，可以通过对含有杂质与降解产物的试样，与另一个已经验证的方法进行对比。这里含有杂质的试样对于API来说，有可能来自于前道没有经过提纯的工艺，或者是通过强光，高温，高湿，酸碱水解或氧化的方式获得，同时对比破坏前后的杂质，必要时采用二级管阵列检测器或质谱检测器，进行峰纯度的检查。

检测限则是指试样中的被测物能够被检测出的最低量，药品的杂质测定应通过测试确定方法的检测限。

非仪器的目视检查法可用已知浓度的被测物质，试验出能可靠检测出最低浓度或量的杂质水平；

对于仪器法，通常采用能显示基线噪音的分析方法，将已知浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠检测出的最低浓度或量，一般采用3：1或2：1的信噪比时相应的浓度做为检测限。

接下来进行杂质定量测定的验证要求的相关讲解。

相比较限度测定几个关键的参数指标专属性、耐用性和检测限而言，杂质的定量测定又多了精密度、准确度、定量限、线性、范围的要求，可以说是各类方法验证的类型中最为复杂的一种，这在各国或者机构的药典中要求基本上都是类似的，详细可参见下面的这张附件表格（来自GMP验证指南）。

准确度是指被验证的分析方法测量的结果与真实值或参考值之间接近的程度，一般用回收率表示。

对于杂质的定量测定而言，可采用以下三种方法：

1）向原料药或者制剂中加入已知量杂质进行测定；通常试验会设计三个不同的浓度80%、100%、120%，每个浓度制备3份供试品溶液，进行测定，计算回收率以及相对标准偏差；

2）如果不能得到杂质或降低产物，可用被验证的方法测定的结果与其他方法进行比对；

3）在不能测得杂质或降解产物的响应因子或不能测得对原料药的相对响应因子的情况下，可用原料药的响应因子，应明确单个杂质和杂质总量相对于主成份的重量比或峰面积比。

精密度是指在规定的测试条件下，同一均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的精密程度。

对于精密度的测试，有的时候容易会有一个误区，认为对一个制备样品重复进样N次就可以考察分析方法的精密度，这其实只是确认了设备的精密度而已，从方法验证的角度来看，方法精密度的验证应该包括整个样品的制备过程。

精密度的方法验证又可以进一步细分为：

重复性：相同条件，同一人不同操作的结果精密度

中间精密度：同一实验室，不同时间，不同人，用不同设备的结果之间的精密度

重现性：不同实验室，不同分析人员测定结果之间的精密度。

精密度测试对于杂质定量以及含量测定两大类定量方法而言，差别并不太大。

精密度与准确度是定量性质的方法验证的最重要的两个指标，两者的关系可以参见下面的图片：

定量限则与之前提到的检测限多少有些类似，只不过杂质定量限所采用的信噪比一般为10：1时相应的浓度为结果来确定注入仪器的量确定定量限。

最后两个指标，线性与范围其实在某种程度上有一定的类似，接下来进行关于含量的方法验证的相关讲解。

杂质除了定量的要求之外，可能还会有限度检查的要求，限度检查从药典的要求上来看，比杂质的定量测定要求的项目要少，包括专属性、检测限及耐用性。

与前文提到的杂质定量测定的要求类似，对于杂质限度检查的专属性而言，需要根据杂质是否可获得分两种场景进行考虑，比如最近沸沸扬扬的华海的缬沙坦事件中提到的微量杂质N-亚硝基二甲胺（NDMA），在这两天报告中提到，NDMA暂定的每日最大摄入量参考限定值为0.1微克，相当于EMA暂定参考限定值0.3ppm（按每日服用320mg缬沙坦计算）就属于这种杂质可获得的场景。

杂质限度检查中的杂质有很大的可能是工艺过程中引入，或者由于降解所产生，专属性的要求是具有一定的分离度，必要时可采用二极管阵列检测或质谱检测器，进行峰纯度的检查。方法验证的文件中如果采用的是色谱法，应附代表性图谱，以说明方法的专属性，并应标明各个成份在色谱图中的位置，色谱法的分离度应符合要求。

检测限也有两种方法，分别是：

1）非仪器分析的目视法：用已知浓度的被检测物、试验出能被可靠检测出的最低浓度或量。经典的公式是L=CV/S，限度可以根据标准溶液的体积乘以浓度，再除以样品量得到；

2）信噪比法：与定量限方法验证的要求不同，检测限要求的信噪比为3：1或者2：1，即已知低浓度试样测出的信号与空白样品的信号比值应该通过方法验证证明。

此外，还可以根据响应因子的标准偏差和斜率计算出检测限，当校正曲线包含检测限范围的分析物浓度时，采用校正曲线的回归线剩余标准偏差或回归线截距的标准偏差可以做为响应因子，3.3倍的响应因子除以校正曲线的斜率，可以做为检测限。

检测限方法验证应该包括相应的测试过程的描述，附有相应的测试图谱并且说明检测限的结果，未来在制订质量标准的时候，杂质的限度必然是大于检测限的数值。

       文章来源：药视网

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