Caco-2 细胞模型不同取样方式对药物表观渗透系数的影响

Caco － 2 细胞来源于人类结肠癌细胞，在常规细胞培养条件下，即可自发分化形成肠细胞样的细胞。与人小肠上皮细胞在形态上非常相似，具有相同的细胞极性和紧密连接，因此，可以作为研究药物的肠道渗透性模型［1］。
当使用Caco － 2细胞模型研究药物渗透性时，常采用两种取样方式。一种为间隔一定时间进行取样，计算不同时间点的累计释放量，以其累计释放量对时间进行线性回归，通过回归方程斜率计算药物表观渗透系数( Papp ) ［2］; 另一种为在实验结束时，从Transwell小室单侧进行单次取样［3］。
为考察这两种取样方式对药物的Papp 测定是否存在差异，现采用已知高渗模型药物酒石酸美托洛尔、中渗模型药物阿替洛尔、以及未知渗透性分类药物甲硝唑作为模型药物，分别对两种取样方式测得的Papp值进行比较，为日后Caco － 2 细胞模型测定药物渗透性实验的取样方式提供参考［4］。
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实验部分 
1.1 仪器、试药与菌株
Countess II 细胞计数器( 美国Invitrogen) ; MEＲS00002 Millicell EＲS － 2 细胞电阻仪( 美国Millipore) ; 20A 高效液相色谱仪( 日本岛津) 。酒石酸美托洛尔、阿替洛尔( 中国食品药品检定研究院，批号分别为: 100084 － 201403、100117 －201606) ; 甲硝唑( 广西金兴实业有限公司) ;Hank’s 平衡盐溶液( 北京索莱宝科技有限公司) ; DMEM 培养基( 美国Gibco) ; FBS( 上海中乔新舟生物科技有限公司) ; 青霉素－ 链霉素双抗液、胰蛋白酶( 美国HyClone) ; MTT ( 北京百灵威科技有限公司) ; PBS 缓冲液( 北京中杉金桥生物有限公司) 。Caco － 2 细胞株( 美国模式菌种收集中心，批号: HTB － 37，传代数为30 ～ 40 代) 。
1.2 方法与结果
1.2.1 Caco － 2 细胞模型的建立与评价
将Caco － 2细胞培养于细胞瓶中，并置5% CO2、37 ± 1 ℃ 培养箱中，细胞所需营养物质为15%DMEM 高糖培养液( 含有15%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1% 100 U·mL －1  青霉素G 以及100μg·mL － 1链霉素) 。待细胞生长至对数期后，采用灭菌后的PBS 缓冲液清洗，并加入0． 25%Trypsin － EDTA 消化液消化细胞，于1． 2 × 103 r·min －1 离心3 min，弃去上清液，并重新添加培养基吹打细胞，待细胞分散均匀后，对细胞进行台盼蓝染色并计数，以每毫升1 × 105  个的细胞密度接种于Transwell 12 孔板，其中，AP 侧为0． 5 mL 相应密度的细胞悬液，BL 侧为1． 5 mL 的DMEM 高糖培养液，置恒温培养箱中，连续培养21 d。接种后的前一周，隔天换液，一周后，每天换液，并测量扩膜电阻值( TEEＲ 值) ，以跨膜电阻值来判定Caco －2细胞层的完整性，文献显示: 当Transwell小室内的跨膜电阻值≥220 Ω·cm2，可用于药物渗透性转运的模型［5］。记录实验前后的细胞跨膜电阻值，以判断实验结束后，细胞膜是否完整。实验前后的细胞跨膜电阻值见表1。

Caco － 2 细胞单层细胞的TEEＲ 值大于300 Ω·cm2，据文献中报道，当TEEＲ 值≥220 Ω·cm2时，表明单层细胞的紧密型和完整性良好，建立的Caco － 2 细胞模型满足要求，可以用于Caco － 2细胞转运实验。在实验前后，细胞跨膜电阻值虽略降低，但仍达到了单层细胞TEEＲ值大于300 Ω·cm2 的要求，表明在实验过程中，细胞单层膜未被破坏。
1. 2. 2 安全范围的确定
采用MTT 法，将Caco －2 细胞以每孔5 × 103个细胞的密度接种于96 孔板中，在5% CO2、37 ± 1 ℃条件下培养，待细胞生长至对数期时，进行实验。分别设置空白组、对照组、实验组，每组设6 个复孔。其中，空白组为调零组，未接种细胞，仅用200 μL Hank’s 平衡盐溶液孵育; 对照组为200 μL Hank’s 平衡盐溶液，与空白组差异在于对照组接种细胞; 实验组为用200 μL Hank’s 平衡盐溶液配制的5、10、20、50、100、200 μg·mL －1系列浓度含药液( 含酒石酸美托洛尔、阿替洛尔、甲硝唑) 。在5% CO2、37 ±1 ℃条件下孵育3 h，弃去给药液及Hank’s 平衡盐溶液，避光条件下，各组细胞中分别加入200μL 0． 5 mg·mL －1 MTT 液，同等条件下孵育4 h后，弃去MTT 液，再加入150 μL DMSO 溶解生成的甲瓒结晶，采用酶标仪，测定570 nm 处的吸光度值( OD 值) ，并按照公式“存活率( %) =( OD实验组－ OD空白组) /( OD对照组－ OD空白组) ×100%”计算细胞的存活率。实验所涉及浓度的细胞存活率均＞ 80%，确定3 种药物混合含药液的安全浓度范围为5 ～ 200 μg·mL－1 ［4］。
1. 2. 3 样品的前处理与色谱条件
在转运实验过程中得到的间隔取样细胞样品及单次取样细胞样品，均经过台式高速冷冻离心机，以1 × 10 4 r·min －1  离心10 min，取上清液，得到离心样品。采用Sepax Nu － 1Q C18色谱柱( 250 mm × 4． 6mm，5 μm) ，检测波长226 nm，流速1． 2 mL·min －1，柱温35 ℃，进样量10 μL。取27． 201 g 无水磷酸二氢钾加入160 mL DI 水中，用磷酸调pH3． 0，并用水补至200 mL，再与水以4∶71 比例混匀，即得3. 75 L 流动相A; 流动相B 为纯甲醇。梯度洗脱( 0 min、80% A， 15 min、60% A， 19 min、60% A，20 min、80% A，26 min、80% A) 。
1. 2. 4 专属性试验与标准曲线的建立
取混合对照品、酒石酸美托洛尔对照品、阿替洛尔对照品、甲硝唑及空白细胞等溶液，分别进样10 μL。空白细胞液对酒石酸美托洛尔、阿替洛尔、甲硝唑药物的检测均无干扰，且3 种药物之间无相互干扰。称取适量酒石酸美托洛尔、阿替洛尔、甲硝唑，配制9 个不同浓度的对照品溶液，酒石酸美托洛尔、阿替洛尔、甲硝唑的浓度范围分别为0． 82 ～ 135． 72、0． 43 ～ 65． 41、0． 88 ～ 133. 87 μg·mL －1 。取以上溶液，分别进样10 μL，记录色谱图，以进样浓度( μg·mL －1 ) 为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程分别为:Y酒石酸美托洛尔= 1． 3280 × 104 X －1 ． 9966 × 103、Y阿替洛尔=1． 9318 ×104 X －2 ×103、Y甲硝唑= 9． 5248 ×103X －1 ． 8813 × 103 ( r2均为0． 9999 ) ，0． 82 ～135. 72 μg·mL －1酒石酸美托洛尔、0． 43 ～ 65． 41μg·mL －1 阿替洛尔、0． 88 ～ 133． 87 μg·mL -1 甲硝唑与峰面积呈良好的线性关系。
1. 2. 5 进样精密度的试验
取任一对照品溶液，进样10 μL，连续进样6 次，测定峰面积。计算得酒石酸美托洛尔、阿替洛尔、甲硝唑峰面积的ＲSD 分别为0． 8%、0． 4%、0． 5%。
1. 2. 6 回收率的试验
精密称取适量酒石酸美托洛尔、阿替洛尔、甲硝唑，分别配制成相当于酒石酸美托洛尔、甲硝唑转运给药浓度的80%、100%、120%，50% 阿替洛尔转运浓度的80%、100%、120%，每个浓度配制3 份，分别进样10μL，计算3 种药物的回收率及ＲSD。酒石酸美托洛尔、阿替洛尔、甲硝唑的回收率分别为98. 36%、99． 15%、99． 23%，ＲSD 分别为1． 13%、0. 87%、1． 01%，回收率均为98% ～ 102%，ＲSD均＜ 2%，说明该方法的准确度较好。
1. 2. 7 稳定性的试验
取同一供试品溶液，在37 ℃下放置，分别在样品制备后的第0、0． 5、1、2、4、6 小时进样，测定峰面积。取同一供试品溶液，置室温条件下，分别在样品制备后的第0、1、2、4、6、8、12、24、48 小时进样，测定峰面积。计算得3种药物在37 ℃条件下和室温条件下的ＲSD 均＜2%，表明含3 种药物溶液在37 ℃条件下6 h 内稳定性良好，在室温条件下48 h 内稳定性良好。
1. 2. 8 Transwell 转运试验
将培养至21 d 的Transwell 12 孔板用PBS 缓冲液清洗，洗涤2 ～ 3次，并在AP 侧加入0． 5 mL Hank’s 平衡盐溶液，BL 侧加入1． 5 mL Hank’s 平衡盐溶液平衡15min。之后将两侧Hank’s 平衡盐溶液吸出，并在AP 侧加入0． 5 mL 给药溶液( 酒石酸美托洛尔、阿替洛尔、甲硝唑均为100 μg·mL －1) ，并在Transwell板BL 侧加入1． 5 mL Hank’s 平衡盐溶液作为接收液，各设置3 个复孔，实验过程为120 min，于给药后20、40、60、80、100、120 min 时分别吸取200 μL 接收液作为间隔取样细胞样品，并及时补充等体积的空白Hank’s 平衡盐溶液。将培养至21 d 的Transwell 12 孔板用PBS 缓冲液清洗，洗涤2 ～ 3 次，并在AP 侧加入0． 5 mL Hank’s 平衡盐溶液，BL 侧加入1． 5 mL Hank’s 平衡盐溶液平衡15 min。
之后将两侧Hank’s 平衡盐溶液吸出，并在AP 侧加入0． 5 mL 给药溶液( 酒石酸美托洛尔、阿替洛尔、甲硝唑均为100 μg·mL－1) ，并在Transwell 板BL 侧加入1． 5 mL Hank’s 平衡盐溶液作为接收液，各设置3 个复孔，实验过程为120 min，于实验结束时，从BL 侧吸取200 μL 接收液作为单次取样细胞样品。采用“1． 2． 3”项下色谱条件，测定离心样品中3 种药物的浓度，根据公式“Papp = dQ/dt × A × C0  ”计算Papp( 表2) ［7］。dQ/dt 为单位时间内药物的转运量，为药物累计释放量Q 对时间t 线性回归的斜率，A 为Transwell 12 孔板膜底面积，本实验为12 孔板，底面积为1． 12 cm2，C0 为AP 侧药物初始浓度( μg·mL －1) 。3 种药物的两种取样方式所得Papp 值均无较大差异( P ＞ 0. 05) 。

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讨论 
文中用MTT 比色法检测细胞毒性，通过活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶将MTT 还原成蓝紫色结晶甲瓒，用DMSO 溶解甲瓒，测定OD 值。其OD 值越大，说明生成的甲瓒越多，药物产生的细胞毒性越小［8］。确定细胞的安全范围后，排除细胞浓度对Caco － 2 细胞模型造成损伤的可能性，使实验结果更准确。间隔取样和单次取样为Caco － 2细胞模型验证药物渗透性的两种常用取样方式，现被多数研究者采用。在不同的药物转运实验中，间隔取样应用较多。间隔取样为通过在不同时间点进行取样，计算不同时间点的药物累计释放量，并对时间进行线性回归，计算回归方程的斜率，从而得到表观渗透系数( Papp ) 。
间隔取样的取样量较多，因此，在后续样品处理及检测方面，工作量较大; 且在取样的过程中，细胞孵育环境发生改变，不能保证实验过程中，细胞均处于37 ℃、5%CO2的孵育环境下，且在取样过程中，因在同一时间点对全部实验孔进行操作，细胞在外界环境中所处时间较长，对细胞活性的影响未知。且在间隔取样过程中，操作烦琐，易出现忘记在接受池中补加接收液或多加接收液，此外，多次取样、补液，会更易引起实验偶然误差。但间隔取点在一定程度可以规避某个时间点的偶然性。单次取样方式优点在于取点较少，在样品检测过程中，可大大缩短样品处理及检测所用时长。经研究比较，酒石酸美托洛尔、阿替洛尔、甲硝唑经间隔取样测得的Papp 值和经单次取样测得的Papp 值差异较小，且两种取样方式测得的Papp值差异均无统计学意义。文中数据可为Caco － 2 细胞模型验证药物渗透性实验中的取样方式提供参考。

       文章来源：凡默谷

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