层析填料的寿命验证之如何有效降低填料寿命的衰减

层析填料寿命衰减的原因
层析填料随着其重复的装柱，重复接触待纯化的样品，层析工艺过程的各种缓冲液，维护保养（再生，清洗CIP,消毒，保存）过程而使其动态载量及收率下降，非特异性吸附反压增大的变化导致的寿命衰减或者终止。
层析填料寿命的衰减会影响整个工艺过程的成本，且衰减导致填料性能的变化而不能持续有效的满足工艺要求。

影响层析填料寿命衰减的因素：
1 重复装柱
层析过程是填料装填在层析柱中，由于层析体系的漏气，层析柱密封圈的更换等因素导致的必须拆装柱，每次装柱的过程都涉及到填料的脱气处理，及装填柱床时的压缩柱床，然后脱气时的超声或者抽滤都会对填料施压，压缩柱床也要对填料施压，反复的施压及压力控制不当也会使填料的物理性能发生变化从而影响填料的寿命。
2 样品的状态
a.样品澄清度：样品越澄清对填料的寿命影响越小。
b.样品粘度：样品的粘度越小，对填料寿命的影响越小。
c.样品酸碱度：过酸过碱都会加速填料寿命的衰减。
d.样品离子强度：离子强度越高填料寿命衰减的越快。
e.样品成分组成：样品成分越复杂，层析过程越复杂，填料的寿命衰减越快。
3 层析工艺
a.柱床高度，流速及反压越大，工艺过程填料受到的外力就会增大，填料的寿命衰减就会增大。
b.层析工艺过程的缓冲液的种类及洗脱的CV数也会影响填料的寿命，缓冲液越温和对填料寿命衰减影响越小，洗脱CV数越小对填料寿命衰减影响越小。
4 维护保养
合理的维护保养过程可以降低填料寿命的衰减，但是维护过程的CIP及消毒过程通常都需要剧烈的条件，如强酸强碱等，所以CIP的强度及频率越大对填料的寿命衰减影响越大。
既要及时对填料进行维护保养，又要避免清洗过程对填料寿命的影响，故而层析工艺过程中CIP策略是非常重要的组成部分。
层析填料的保存方式(温度，环境，保存液等）也影响填料的寿命衰减。
有效降低填料寿命的衰减
上面介绍了填料寿命衰减的影响因素，针对这些因素我们可以通过一些方式有效降低其对寿命衰减过程的影响。
1 填料的认知
在层析工艺之前我们要对层析的耐压性，化学稳定性（如化学耐受性），物理稳定性（如压缩因子），保存条件，分离原理，材质做足够的认识，避免不合适的层析过程影响填料的寿命衰减（如IDA-Ni应避免接触氧化剂还原剂和螯合剂)。

2 样品的认知
在层析工艺的时候我们要对我们的样品做足够的认知，包括样品的浓度，样品的组成等做一定的了解（如上游工艺，如真核细胞分泌表达的样品，要了解其上游工艺，培养基组成，培养过程等的一些添加剂是否对填料的性能及寿命衰减会有影响）。
3 样品的前处理
a.样品中的颗粒物质在层析前要进行澄清处理，澄清处理的越彻底，对填料寿命衰减影响越小。
b.样品的粘度要尽量小。
c.样品的组份应满足层析工艺且对填料的性能没有影响，必要时可以用汇研生物的脱盐柱Focudex G-25柱对样品进行换液处理。
4 层析工艺
a.优化柱床高度使其既满足工艺指标，又可减少反压
b.优化层析缓冲液使其对填料寿命衰减的影响最小（比如洗脱强度的合理温和可以降低配基的脱落和基质的老化）。
c.优化层析过程减少非特异性吸附等也可以有效降低填料寿命的衰减过程。
5 维护保养
不同的介质及不同的污染物清洗方法不同，清洗既要保证清洗效果同时要减少对层析介质的损伤，还要避免清洗试剂对介质的二次污染，选择合适的清洗方法非常重要。依据层析介质的污染物的种类进行清洗方法，下面分别介绍不同污染物清洗方法的选择。
清洗是去除再生没有去除的污染物，那么我们就要了解污染物的来源，污染物与物料及工艺阶段，工艺过程联系紧密。
1）捕获阶段，物料通常比较复杂，含有大量的杂质，色素，内素素等，再生往往难以去除干净，那么待清洗去除的物质也很复杂，清洗过程也很复杂，可能需要多种模式配合作用，同时清洗的频率和强度都要高。通常使用1个循环后就要清洗一次。

2）中度纯化阶段，物料已经去除了大部分杂质，通过再生残留在介质上的污染物就很少了，清洗过程和频率比捕获阶段就要低很多。使用5-10个循环后就需要清洗一次。

3）精纯阶段，物料已很纯净，只含有微量的杂质，再生通常就可以达到清洗的目的，此时清洗的频率和强度就更低。根据小试确定的清洗需要开始的状态进行清洗。
a 可溶性杂蛋白的清洗
可溶杂蛋白主要是HCP，可溶性杂蛋白主要是由介质的非特异性吸附或者洗脱强度过低引起的，这个在我们再生的时候通常已经去除干净，若介质被可溶性杂蛋白污染，再生和清洗的过程往往可以合并为一步。

1）离子交换介质用2M的氯化钠洗1-2CV，接触时间控制在15-30min，若清洗完保存，则需要用10mM氢氧化钠或者20%的乙醇流经柱床即可。
2）疏水层析被可溶性蛋白污染时，可用低浓度缓冲或者超纯水，或者30%的异丙醇清洗2-3CV即可，
3）凝胶过滤介质被可溶性杂蛋白污染时，可用2M的氯化钠或者0.1-0.5M的氢氧化钠清洗1CV即可。
4）亲和层析被可溶性蛋白污染时，清洗要依据亲和层析的类型进行选择。

层析介质被可溶性蛋白污染时清洗过程可和再生过程合二为一同时进行。
b 固化的蛋白（沉淀或聚集）的清洗
固化在介质中的蛋白，是介质在使用的过程中，蛋白变性后沉淀在介质，也有可能是介质使用时介质中高密度蛋白聚集而成沉淀（这与物料的性质有关）。固化在介质中的蛋白严重影响介质的性能，要及时清洗。
1）凝胶过滤介质，疏水介质，离子交换介质通常都可以通过0.5-1M的氢氧化钠进行清洗1-2CV即可，清洗完后要立即用水清洗到中性。
2）亲和介质的种类多，亲和介质被沉淀的蛋白污染时要依据亲和介质的种类及耐受性选择合适的清洗方法，部分可通过尿素或等蛋白变性剂清洗1-2CV.
c 疏水性蛋白的清洗
疏水性蛋白污染介质时，离子交换介质，疏水介质，凝胶过滤介质用3-4M的氢氧化钠清洗3-4CV，然后立即用水洗到中性。亲和层析介质则要根据其种类选择合适的方法清洗。
d 脂类物质的清洗
用0.5%的Triton X-100等非离子型去污剂清洗3-4CV,或者30%异丙醇及70%乙醇清洗3-4CV.
e 核酸的清洗
用1M氯化钠加1M氢氧化钠清洗1-2CV,亲和层析介质需要摸索清洗方法。
f 色素的清洗
色素是一类物质，不同来源的色素的清洗过程差异较大，可根据介质的性质及色素的性质进行清洗，碱洗，酸洗，有机溶剂，及去污剂，变性剂都可以尝试。
g 内毒素及微生物的清洗
内素素及微生物的清洗通常用0.5-1M的氢氧化钠清洗1-2CV之后，再用超纯水冲洗至中性。亲和层析介质可通过0.5%的非离子型去污剂及有机溶剂的方式清洗内毒素。

清洗过程注意事项：
1）清洗过程要综合考虑污染物的类型及介质的种类，清洗的同时要减少对介质的损伤。
2）清洗时通常需要多种方法组合使用，清洗过程并非是固定不变的。
3）清洗试剂应选择纯度高的试剂，避免二次污染。
4）清洗之后要立即洗到中性保存。
5）清洗状态的确定及方法的确定要结合整个工艺过程。
6）清洗之后要对清洗过程进行验证，保证清洗目的实现，可通过测定载量，流速等介质的性能指标验证

6 层析设备的选择
层析柱的分布器，清洗死角，密封性，材质也会影响层析填料的寿命。

       文章来源：允咨GMP制药技术

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