【纯干货】柱效测定的那些事儿

一、柱效测定的原理

柱效检测是示踪物质流经柱床时的保留时间的分析，测定柱效的方法有两种，一种是 pulse test（脉冲式测试），另一种是 step test（步级测试）。

1. Pulse test

Pulse test 是目前最常用的测试方法，即使用少量的样品流经装填好的层析柱中，通过 ÄKTA 上的检测器监测实验过程，实验结束后对洗脱峰进行积分分析。
我们主要利用塔板理论中的两个参数来判断柱效，如下图 1 所示：
理论塔板高度（HETP，height equivalent to a theoretical plate ）或每米塔板数（N/m）
对称性：由 As（asymmetry factor）来描述，通过对 10% 峰高处的峰宽进行计算得到，As=b/a

为了便于比较不同高度和粒径的柱效，引入了「h」（Reduced plate height）的概念，用 HETP 除以填料粒径（dp），即可算出 h 的大小，它表示在一层塔板中存在的填料小球堆叠的个数。

图 1 Pulse test 柱效检测的术语示意图

一般，当 h ≤ 3 ，0.8 < As < 1.8 时认为柱子装填的效果比较好。当然，对于不同的层析步骤，h 和 As 的标准也并不相同。不同的层析技术对柱效的要求的严格程度是不同的。在几种吸附型层析中，对柱效的要求程度，离子交换/疏水层析＞亲和层析。而非吸附型层析，即凝胶过滤/分子筛，对柱效的要求一般比较高，根据应用的不同，精细分离＞组群分离。

2. Step test

而 step test 是通过不同的缓冲液分别流经层析柱，即一种称之为「step」的方式来测定柱效，这种方式经常在大规模生产使用，可以通过层析过程中盐浓度变化的曲线来观察柱效变化，而不需要额外进行柱效测定的步骤。
我们可以使用 Unicorn 软件中的 evaluation 模块通过微分的方式将 step 检测的结果转换为 pulse 的结果形式来进行分析。但是将柱子清洗完后用 Pulse test 进行柱效测定，是更加规范的做法，能清楚了解柱子的完整性。

图 2  Step test 柱效测定
通过 Unicorn 软件将 step test 的结果（左侧）转换为 pulse test 的结果（右侧）形式，进行柱效计算。

二、柱效测定方法

1. 选择合适的测试条件

峰展宽会受到多种因素的影响，包括填料粒径大小、装填均匀度、流速大小、样品粘度等因素。为了给柱效测定设置一个合适的标准，控制这些参数是十分重要的。

01
样品的选择

  样品分子能够完全进入填料的孔隙中，很好对内水和外水的体积进行测定，比如 NaCl 或丙酮。如果有特殊项目需求，可以采用蓝色葡聚糖 2000 作为外水柱效的样品。
  要确保样品不和填料的表面发生相互作用。
  洗脱液和样品的黏度和密度应该尽可能保持接近，使用同样体系进行配制。

如果使用 NaCl 进行测试，流动相一般使用 0.4 M NaCl（35 - 40 mS/cm），以抑制样品和填料之间的电荷相互作用。如果流动相的电导值过低会严重影响柱效测定中峰的对称性而观察到一个前倾的峰（见图 3）。

图 3 使用 NaCl 作为柱效测定样品时，
流动相的电导对对称性结果的影响

02
流 速

因为传质阻力存在，流速越大峰越宽，相对于柱效会变低。但是对于分子大小来说，这种趋势稍微有所差异，小分子更不敏感。一般来说建议采用较低流速进行测定，常用 30cm/h，具体可参考说明书。但是如果节省时间可以加快流速，注意要在流速一致的情况下进行柱效的对比。

03
上样量

通过脉冲式方法测定柱效时，上样体积通常为柱体积的 1%。 

2. 常用 pulse test 柱效测定方法总结

我们可以手动运行柱效测定的流程，也可以通过方法编程进行自动运行。
在 Unicorn 软件中的「method editor」模块中，内置了柱效测定方法模板，即「column performance test」的程序模板（图 4a），方法包含「equilibration」和「column performance test」两个阶段，利用简单填空的方式，将流速、上样体积等条件添加进去（如图 4b 中所展示的平衡 phase），就可以自动运行一个柱效测定的程序啦！

图 4  利用柱效测定模板运行柱效测定程序

3. 利用 unicorn 软件计算 HETP 和 As

柱效测定实验完成后，我们需要利用 HETP 和 As 两个参数定量描述我们的装柱效果，不用担心复杂的计算，Unicorn 软件全部可以搞定！
在「Evaluation」模块中打开运行之后的结果，点击上方工具栏「Peak Integrate」图标，如下方红色方框所示（图 5a），可以对峰进行积分。在积分表格旁的空白处，右击鼠标，选择「customize」选项，勾选「HETP」和「As」（图 5b），结果就会出现在积分表格中。

a 工具栏中的积分选项

b 在 customize 中，勾选「HETP」和「As」
图 5 利用 Unicorn 功能计算装柱结果

       文章来源：允咨生物GMP学苑

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