干货 | 细胞手工计数方法简介

一、血球计数板结构
细胞手工计数板核心是血球计数板，市面上卖的一般都是有医疗器械号（国产进口均可用，不用挑哈）。血球计数板是一块比普通载玻片厚的长方形玻片，在中部1/3面积区域有4条凹槽，将中部区域分为3个长方形平台；其中正中间的平台又被一短横凹槽分隔为两半，作为两个计数池，两个计数池平台高度比两边略低0.1mm。

在显微镜下，每一个计数池均可以看见以下网状结构，9个同面积的大方格组成方格网，大方格作为计数室（绿色和蓝色方框区域）。计数室边长为1mm，盖上盖玻片后容积为：1mm(长)x1mm(宽)x0.1mm(高)=0.1mm3，即一个计数室的体积为0.1mm3,也就是1x10-4mL。我们只要把这个计数室里面的细胞数清楚，再乘以104，我们就可以得到每毫升样本中的细胞个数。

了解了计数室的体积，咱们还需要了解计数室的刻度规格。一般一个计数室会被分为400个小方格，有两个划分形式：（1）25x16，一个计数室划分为25个中方格，每个中方格再划分为16个小方格；（2）16x25，一个计数室划分为16个中方格，每个中方格划分为25个小方格。因此，不管哪种规格，小方格的面积均为1/400mm2。
接下来就是数数了。以上图血球计数板为例，该计数板左边三个参数：规格为XB-K-25，表示计数室有25个中方格，0.1mm代表计数室高度，1/400mm2代表一个小方格面积。
针对红细胞和血小板的计数，通常我们会选取上图所示5个中方格（红色方格区域）内的细胞进行统计，随后取其平均数，再乘以25，即可得到计数室细胞总个数（如果不嫌麻烦直接把计数室细胞全部数完也可以哈~~），再乘以104即可算出每毫升样本中的细胞数量。
针对白细胞及胰酶消化后的贴壁细胞和悬浮细胞的计数，通常我们会选取上图所示的四个大方格（绿色方格区域）内的细胞进行统计，将4个大方格内的细胞数完求和，随后总数除以4，再乘以104即可算出每毫升样本中的细胞数量。

二、手工计数操作要点
首先，计数板需要清洗干净，使其干燥，不能有油脂或者灰尘，盖玻片亦如此，不干净的计数板严重影响计数结果的准确性。
其次,提前预估细胞量，细胞浓度太低误差大，细胞浓度太大容易数花眼。最好使其浓度在0.5-5x106个/mL，也就是每个计数室50-500个细胞，细胞数目过多，则需要进一步稀释；细胞数目过少，则需要离心再悬浮。
第三，尽可能使细胞分离成单个，无团块无杂质；计数前快速吹打均匀，尤其是多次取样计数时更要注意每次都要混匀，操作尽量迅速。
第四，细胞液滴加到计数室再盖盖玻片，亦可先盖玻片，从侧面通过液体毛吸作用到达计数室，液体太多容易测流到计数板小沟，细胞容易被流走；液体太少容易在计数室或者附近形成空泡。如出现以上情况，则需准备细胞和计数板重新计数。
第五，数细胞的原则是只数完整的细胞，若少量细胞聚集成团，只按照一个细胞计算；如果细胞压在格线上，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。
第六，如果细胞需要台盼蓝染色，必须充分混匀并且不要忘记计算时乘以倍数；
第七，滴加细胞过程中，滴加后移动计数板以及计数过程中都要保持计数板水平不晃动，防止细胞液体侧流带动细胞流失或者局部聚集。
第八，建议细胞计数板上下两室都计数然后取平均或者多次计数取平均，准确的计数应该是多次计数结果差别很小，或者稀释一定倍数后计数结果依然吻合。

       文章来源：生物制品圈

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