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使用说明：
电泳前，禁止将电泳槽附带电源导线连接到电泳仪电源上。
一、制胶：
1、置凝胶溶液。
2、架制胶室。在一块玻璃的两边各放一根制胶隔条，(或制胶方框)然后把另一块玻璃放在上面，用夹子夹好两块玻璃板便制成了一个胶室。下端不需要密封。
3、灌胶。将胶室平放在平台上，把配好的凝胶溶液吸入一只注射器中，直接灌入制好的胶室中。注意灌胶时胶室要从玻璃板的一侧逐渐灌入，同时用手指弹击胶室，以避免在灌入的凝胶溶液中产生气泡。灌入的胶液在液体的张力作用下是不会泄漏的。这样灌满凝胶溶液的胶室在室温条件下放置 2 小时，溶液即凝固成胶了。
4、保存。如果当天就要进行电泳，凝固的薄层胶片需在 4℃冰箱中放置 1 小时，然后取出使用。如果不是当天使用，则可以把凝固的薄层胶片放入一个低温的湿室环境内保存。用普通的大号培养皿，按其大小剪好两张圆形滤纸片，滴上少许蒸馏水使之浸湿，贴在皿内的上下表面，即成为一个简易的湿室。这样把薄层胶片放入其中，保存在 4℃冰箱内，可供数周之内使用。
二、样品的预处理
样品的高盐浓度影响载体两性电解质 PH 梯度的形成，从而导致区带的歪斜，对这样的样品需要事先透析除盐。样品的低盐浓度不利于蛋白质溶解，常用 1%甘氨酸或载体两性电解质为溶剂溶解这样的蛋白质样品。某些蛋白质在其等电点附近沉淀，可以在凝胶中加入尿素，无离子或两性离子去垢剂来助溶。此外，样品应预先去除颗粒，以免它们停留在加样处，造成拖尾现象。
三、样品的施加
揭开部分胶框,用两个小钢铲,旋转另一个小钢铲,揭去上层的玻璃板。注意要小心的操作，避免薄层胶片脱离下层的玻璃板。样品直接加在薄层胶片上有许多种方式。一般是用一叠 8 层的擦镜纸，剪成 0.4×0.5cm的小方块，先贴在胶片上，再用微量注射器滴加一定量的样品；亦可以把小块直接浸入样品溶液中，再贴在胶片上，这样的加样量大约为 10μl。加样量一般按所分析样品中蛋白质的类型和数目而定。用考马斯亮蓝染色，一般可加蛋白质 1—10μg；用酶活性染色，可依所显示的酶的区带的深浅程度来调整酶样品的浓度。
四、电极液的施加
电极液采用 1MHaPO4 为阳极液，1MNaOH 为阴极液，以适应 PH3.5－10.0 范围的载体两性电解质形成相应的 PH 梯度。用 3 片为一叠的.5mm 宽的 whatmanl#滤纸条来浸湿电极液，然后分正负极，贴加在薄层胶片的两端。电极滤纸条要贴加得平行，以便使铂金丝电极正好压在它们的上面。
五、电泳的条件
把载有加好了样品和电极滤纸条的薄层胶片放在电极架的下架上，盖好上架，使得电极丝和电极滤纸条充分接触，成为一体，接通正负电极，即可开始电泳。这样简单的薄层等电聚焦电泳在 4℃冰箱中进行，如需要也可在室温下通冷却水电泳。一般所给的条件是：起始电压为 60V，15 分钟调** 120V，转而恒流，每厘米胶片长度 0.8—1.0mA，约 1 小时左右，电压便上升到 600—700V，维持 3—3.5 小时即可结束电泳。
六、PH 梯度的测定
把 1 ×7cm的薄层切下来，从正极端到负极端切分为 14 等份，每份加 0.4ml 重蒸水，搅碎后用微量电极在一般的酸度计上测定它们的 PH 值，依此数据描绘出 PH 曲线。
七、染色及保存
蛋白质染色步骤如下：1、5%磺基水杨酸＋10%三氯醋酸（W／V）固定 1 小时；2、过脱色液 35%无水乙醇＋10%冰醋酸（W／V）45 分钟；3、染色液 0.2%考马斯亮蓝 R250的脱色液溶液（W／V）染色 30 分钟；4、置脱色液（同 2）中，37℃温箱内过夜。小肽染色步骤如下：1、10%三氯醋酸固定过夜；2、染色液染色三小时，染色液的配制是 50ml 考马斯亮蓝 G250 加 50ml21mol／LH2SO4,不断摇动 3 小时，过滤，取 9ml 滤液加 1ml10mol／LKOH，然后加 1.36ml100%三氯醋酸。3、用蒸馏水漂洗背景。活性染色依特异的组织化学方法进行。染色后的胶片可放在 20%甘油中或放在温室的环境中，在冰箱中保存，也可制成干片。
八、等电点的测定
测量染色后所分离的区带距正极端的长度，按 PH 曲线找出其响应的等电点来。
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