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琼脂糖凝胶电泳实验流程介绍
试剂准备:
5xTBE缓冲液:450 mmol / L三硼酸,10 mmol / L EDTA,pH 8.0。使用时,将上述存储溶液稀释至0.5倍TBE缓冲溶液10倍,可同时用作电泳和凝胶制备的缓冲溶液。
制胶:
1.根据凝胶量和凝胶浓度,向琼脂糖瓶中加入一定量的电泳缓冲液(琼脂糖粉的总液体量不得超过锥形瓶容量的50%)。
2.用保鲜膜或牛皮纸盖住锥形瓶的嘴,在膜或纸上打一些小孔,然后在微波中加热并溶解琼脂糖。加热时,当溶液沸腾时,戴上耐热手套并小心地摇动锥形瓶,以充分均匀地溶解琼脂糖。重复该操作几次,直到琼脂糖完全溶解。
3.让溶液冷却至约50°C-60°C。如有必要,添加溴化乙锭溶液(终浓度为0.5μg/ ml)或以1μL/ 30 mL的比例添加DNAgreen染料,并充分混合。
4.将琼脂糖溶液倒入橡胶模具中,然后将梳子插入适当的位置。凝胶的厚度通常在3至5mm之间。上胶模具如下图所示。对于小胶水,倒入约25-30 mL的琼脂糖溶液,对于大胶水,倒入约60-70 mL。如果需要切割和回收凝胶,可以适当地增稠凝胶。
5.让胶水在室温下凝固约30分钟至1小时。
上样:
1.将适量的样品与6x上样缓冲液混合(例如:1μl样品和5μl6x上样缓冲液),然后用微量移液器小心地将其添加到样品孔中。
2.可根据样品浓度调节样品量。如果DNA含量低,则可以按照上述比例增加样品量,但总体积不得超过样品罐的容量(小孔通常为40μl,大孔通常为200μl上限取决于粘合膜的规格。
3.添加每个样品后,请更换移液器吸头,以防止相互污染。装入样品时要小心,以免损坏凝胶或刺穿样品罐底部的凝胶。
电泳:
1.添加样品后,关闭电泳槽盖并立即打开电源。控制电压保持在110 V,电流大于40 mA。
2.当条带移离凝胶前端约2 cm(约40分钟)时,停止电泳。
3.拍照并在紫外线下观察。
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