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大肠杆菌感受态细胞的制备注意事项
1. 无菌操作
所有实验器材（如试管、枪头、离心管、量液器等）需在高压条件下灭菌处理，确保无菌环境。
实验过程中避免试剂交叉污染，尤其是DNA酶与其他试剂的混淆。
2. 菌液选择
用于制备感受态细胞的菌液应直接从-20℃或-70℃保存的菌液中转接，避免使用储存在4℃或多次转接的培养菌液。
菌液应处于对数生长期，细胞密度以OD600值在0.4-0.6之间为佳。
3. 试剂与材料
使用高纯度的试剂（如CaCl₂、甘油等），并用超纯水配制，确保试剂分装保存于干燥阴凉处。
LB培养基需准确配制，pH值调至7.0，高压灭菌后使用。
4. 操作步骤
在CaCl₂低渗溶液中处理菌液时，操作需轻柔，避免细胞破裂，离心速度控制在2500-3000 rpm。
热激处理时，温度和时间需严格控制，通常为42℃、90秒，以促进DNA吸收。
5. 细胞保存
制备好的感受态细胞可加入15%甘油，分装后保存于-80℃，可保存半年。
避免反复冻融，以免影响细胞活性和转化效率。
6. 质粒与DNA
用于转化的质粒DNA应为超螺旋态（cccDNA），浓度适中，体积不超过感受态细胞体积的5%。
外源DNA的浓度与转化效率在一定范围内成正比，但过量会降低效率。
7. 环境控制
实验过程中保持低温环境，菌液处理时需冰浴，避免细胞活性下降。
使用恒温摇床和培养箱，确保培养条件稳定（如37℃）。
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