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MGI-测序仪原理

基因测序仪又称DNA测序仪,是测定DNA片段的碱基顺序、种类和定量的仪器。...

 

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主要应用在人类基因组测序、人类遗传病、传染病和癌症的基因诊断、法医的亲子鉴定和个体识别、生物工程药物的筛选、动植物杂交育种等方面。

原理:
目前DNA测序仪的工作原理主要基于Sanger发明的双脱氧链末端终止法或Maxam-Gilbert发明的化学降解法。这两种方法在原理上虽然不同,但都是根据在某一固定的位点开始核苷酸链的延伸,随机在某一个特定的碱基处终止,产生以A、T、C、G为末端的四组不同长度的一系列核苷酸链,在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行片段的分离和检测,从而获得DNA序列。由于双脱氧链末端终止法更简便和更适合于光学自动探测,因此在单纯以测定DNA序列为目的的全自动DNA测序仪中应用广泛。而化学降解法在研究DNA的二级结构以及蛋白质-DNA相互作用中具有重要的应用价值。这里主要介绍双脱氧链末端终止法的测序原理 [1]  。
双脱氧链末端终止法测序是利用DNA的体外合成过程-聚合酶链反应,在DNA聚合酶的催化作用下,以目的DNA为模板,按照碱基互补配对原则,在引物的引导下完成。
普通的PCR反应体系中,加入的核苷酸单体为4种2-脱氧核苷三磷酸(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)。测序反应体系中,加入的核苷酸单体为2,3双脱氧核苷三磷酸( ddNTP)。与dNTP相比,ddNTP在脱氧核糖的位置上缺少个羟基,反应过程中虽然可以在DNA聚合酶作用下,通过其磷酸基团与正在延伸的DNA链的末端脱氧核糖-OH发生反应,形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中,但它们本身没有-OH,不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键,从而使正在延伸的DNA链在此终止。
根据这一原理分别设计四个反应体系,每一反应体系中存在相同的DNA模板、引物、四种dNTP和一种ddNTP(如ddATP),则新合成的DNA链在可能掺入正常dNTP的位置都有可能掺入ddNTP,导致新合成链在不同的位置终止。由于存在ddNTP与dNTP的竞争,生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段。
将制得的四组混合物全部平行地点加在电泳板上进行电泳,每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离,从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列,如图所示。

分类:
根据电泳类型分为平板型电泳和毛细管电泳两类:
1. 平板型电泳:平板型电泳的凝胶灌制在两块玻璃板中,聚合后厚度一般小于0.4mm或更薄,因此又称为超薄片层凝胶电泳。是经典的电泳技术,具有样品判读序列长(600-900bp)、一块凝胶板上可同时进行多个样品测序的优点。
2. 毛细管电泳:将凝胶高分子聚合物灌制于毛细管中(内径50~100um),在高压及较低浓度胶的条件下实现DNA片段的快速分离。是一种快速、高效、进样量少、灵敏度高的技术,可测序列达到750bp左右。

临床应用:
1. 在感染性疾病诊断上的应用
测序技术可以精确的分析碱基序列,通过序列比对,对各种病原体直接进行鉴定、分型和溯源,明确某一感染性疾病对应病原体的基因序列,可以有针对性地用药和预防,提高用药的有效性和安全性。同时基因测序可以用于发现新型病原体,能更好地做好预防工作。
2. 在遗传性疾病诊断上的应用
由于基因突变而导致的疾病具有遗传性和终身性的特点,一旦患上这种病,会给自身和整个家族带来痛苦。通过对被检人员进行基因测序,查看基因突变情况,判断是否存在基因遗传病,或者推断后代患病的概率为婚育提供指导,减少遗传性疾病的发病率。
3. 在肿瘤诊断上的应用
肿瘤的发生是遗传基因和环境因素共同作用的结果,其中遗传基因是内因,与人体是否具有肿瘤易感基因有关。肿瘤易感基因的检测可以检测出人体内是否存在肿瘤易感基因或家族聚集性的致癌因素,根据个人情况给出人性化的指导方案。
4. 在药物易感基因上的应用
个体基因型的差异可能会使相同的药物有不同的用药结果,确定患者相应的基因型实现更精准的用药,更大程度的提高用药效果。
5. 在无创产前筛查上的应用
抽取孕妇血液可以检测出胎儿的基因,通过基因测序对胎儿进行产前筛查,提前知晓胎儿的健康状态,例如针对唐氏综合征的筛查。

发展历史:
1. 第一代DNA测序技术
1977年,Sanger等提出了经典的双脱氧核苷酸末端终止测序法。此后,在Sanger法的基础上,20世纪80年代中期出现了以荧光标记代替放射性同位素标记、以荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射性自显影的自动测序仪。另外,90年代中期出现的毛细管电泳技术使得测序的通量大为提高。
传统的第一代测序技术具有高准确性和简单、快捷等优点,但由于测序通量低,仅适用于小样本遗传疾病基因的鉴定,难以完成没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查。
2. 第二代DNA测序技术
进入21世纪后,第二代测序技术诞生。主要是将片段化的基因组DNA两侧连上接头,随后用不同的方法产生几百万个空间固定的PCR克隆阵列。然后进行引物杂交和酶延伸反应。经过计算机分析获得完整的DNA序列信息。
与第一代技术相比,第二代测序技术不仅保持了高准确度,而且大大降低了测序成本并极大地提高了测序速度。第二代测序技术最显著的特征是高通量,一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序,使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行。
3. 第三代DNA测序技术
第三代测序技术的显著特征是长读长,在保持高准确度的同时可明显将测序读长再提高10-50倍。第三代测序技术解决了第二代测序技术在测序文库制备时所必需的PCR放大过程,一定程度上消除了PCR所引入的系统误差,同时也减少了整体实验运行时间。
4. 第四代DNA测序技术
第四代DNA测序技术同样属于单分子测序,但其利用纳米孔芯片检测单分子测序信号的技术原理不再依赖高速摄像机或者高分辨率的CCD相机,最大程度上降低了检测设备的成本。大多数纳米孔测序技术的基本原理是当DNA分子从一个孔洞经过时检测到被影响的电流或光信号。由于与第三代测序技术相比具有质的飞跃,通常称之为第四代测序技术。

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