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原理：
储液器中的流动相被高压泵打入检测系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样本溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的“吸附-解吸”的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样本浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式输出检测结果。
根据分离机制的不同，HPLC原理可分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法及分子排阻色谱法。
1. 液固吸附色谱法
液固吸附色谱法中，固定相为固体吸附剂，根据各组分吸附能力差异而使组分得以分离。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，大多数用于非离子型化合物。吸附色谱固定相可以分为极性和非极性两大类。对流动相的要求为：
1) 选用的溶剂应当与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。
2) 选用的溶剂应有高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。
3) 选用的溶剂性能应与所使用的检测器相匹配，如果使用紫外吸收检测器，就不能选用在检测波长下有紫外吸收的溶剂；若使用示差折光检测器，就不能用梯度洗脱。
4) 选用的溶剂应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏度。
5) 选用的溶剂应具有低的黏度和适当低的沸点。
6) 应尽量避免使用具有显著毒性的溶剂，以保证工作人员的安全。
液固色谱法是以表面吸附性能力为依据的，所以它常用于分离极性不同的化合物，也能分离那些具有相同极性基团，但数量不同的样品。
2. 液液分配色谱法
固定相为液体，根据被分离的组分在流动相和固定相中的溶解度不同而分离。依固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法和反相色谱法。正相色谱法采用极性固定相，流动相为相对非极性的疏水性溶剂，常用于分离中等极性和极性较强的化合物；反相色谱法一般用非极性固定相，流动相为水或缓冲溶液，适用于分离非极性和极性较弱的化合物。其中，反相色谱应用最广。
3. 离子交换色谱法
固定相是离子交换树脂。树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。
4. 分子排阻色谱法
分子排阻色谱法又称凝胶色谱法，它是按照分子尺寸大小顺序进行分离的一种色谱方法。分子排阻色谱法的固定相凝胶是一种多孔性的聚合材料，有一定的形状和稳定性，利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。根据所用流动相的不同，凝胶色谱法可以分为两类：即用水溶剂做流动相的凝胶过滤色谱法(GFC)与用有机溶剂如四氢呋喃做流动相的凝胶渗透色谱法(GPC)。
延伸
在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定
高效液相色谱法原理
高效液相色谱法原理
相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。
在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。
色谱
（high performance liquid chromatography,HPLC）也叫高压液相色谱（high pressure liquid chromatography）、高速液相色谱（high speed liquid chromatography）、高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）等或Efficient liquid chromatographyspectrometry。是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱。
高效液相色谱是应用最多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利切换严密；由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。HPLC应用非常广泛，几乎遍及定量定性分析的各个领域。
使用高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学和生化分析中。高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。
结构及功能
HPLC仪一般由溶剂输送系统、进样系统、分离系统（色谱柱）、检测系统和数据处理与记录系统组成，具体包括储液器、输液泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪或数据工作站等几部分 [1] 。其中输液泵、色谱柱和检测器是HPLC仪的关键部分 [2] 。
1. 溶剂输送系统
储液器：用来贮存数量足够、符合要求的流动相。配有溶剂过滤器，以防止流动相中的颗粒进入泵内。
脱气器：脱气的目的是为了防止流动相从色谱柱内流出时释放出气泡进入检测器，从而引起噪声，不能正常检测。
输液泵：将储液器中的流动相连续不断地以高压形式进入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。
梯度洗脱装置：是在分离过程中通过逐渐改变流动相的组成增加洗脱能力的一种装置。
2. 进样系统
进样器：是将样品送入色谱柱的装置，进样方式可以分为两种：阀进样或自动进样。比较常用的是采用自动进样器装样。
3. 分离系统
色谱柱：对样品进行分离，是整个色谱系统的心脏，它的质量优劣直接影响到分离的效果。
4. 检测系统
检测器：将色谱柱连续流出的样品组分转变成易于测量的电信号，被数据系统接收，得到样品分离的色谱图。
5. 数据处理和记录系统
对色谱数据进行处理，并参与HPLC仪器的自动控制。
发展历史
1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1960年代末科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯（Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法 (HPLC）正式建立。在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。高效液相色谱同时还极大的刺激了固定相材料、检测技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。
1960年代前，使用的填充粒大于100μm，提高柱效面临着困境，后来的研究人员便采用微粒固定相来突破着一瓶颈。
色谱特点
高压——压力可达150～300 kg/cm2。色谱柱每米降压为75 kg/cm2以上。
高速——流速为0.1～10.0 mL/min。
高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
速度快——通常分析一个样品在15～30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。
色谱柱可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。
样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。
应用
高效液相色谱法只要求样品能制成溶液，不受样品挥发性的限制，流动相可选择的范围宽，固定相的种类繁多，因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。
与试样预处理技术相配合，HPLC 所达到的高分辨率和高灵敏度，使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能，能够分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展，有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离。
HPLC成为解决生化分析问题最有前途的方法。由于HPLC具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用，流出组分易收集等优点，因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。
液相色谱- 质谱联用技术受到普遍重视，如分析氨基甲酸酯农药和多核芳烃等； 液相色谱- 红外光谱联用也发展很快，如在环境污染分析测定水中的烃类，海水中的不挥发烃类，使环境污染分析得到新的发展。
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