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• 样品制备在电泳过程中准确分离蛋白质是蛋白质印迹的关键步骤。它依赖于样品的正确处,以目标蛋白质成为可以通过凝胶进行迁移的形式。 各种样本来源的蛋白质均可以通过蛋白质印迹分析法来分析,如哺乳动物、细菌细胞培养物,或来自临床组织样品,每种样品都需要同的处来产生最终用途的优质蛋白质。不同蛋白质的提取方法详见下表;然而,对于WB法,通常可能并需要如此严格地处方法。 由于免疫印迹的特异性,可以对用于蛋白质印迹的样品进粗略处,以提取蛋白质并将其转移到适合将样品引入分离凝胶进电泳的溶液中。由于存在诸如DNA之类的聚合生物分子,粗制样品尤其可能是粘性的,并且可能会影响凝胶加载。 例一:针对细菌培养样品的制备工艺1.取1ml大肠杆菌培养物样品并转移到冰上的微离心管中。2.在4°C下以13,000rpm转速旋转2分钟。3.弃去上清液。4.在50l上样缓冲液中重悬细胞,并在100°C下煮沸5分钟。5.3,000rpm离心5分钟。6.上样 例二:贴壁细胞例如哺乳动物(HEK293)的示例样品制备。 1.将组织培养板置于冰上,用冰冷的PBS清洗细胞。2.吸出PBS,然后加入适的裂解缓冲液(例如1mL/107个细胞/100mm培养皿150cm烧瓶;每5×106个细胞/60mm培养皿/75cm烧瓶0.5mL)。3.使用细胞刮刀从孔/烧瓶中分离细胞,然后用移液器吸头或通过胰蛋白酶化。4.将细胞悬液转移到预冷的微离心管中。5.然后在4°C下对样品进微离心。条件取决于细胞类型,应根据您的实验设置确定。例如,HEK293可以在1000rpm下耐受15分钟。6.从沉淀的细胞中吸出上清液并转移到冰上的新试管中。7.将负载染加入上清液并在100°C下煮沸5分钟。8.细胞沉淀也可与上清液一起上样染。 将样品以13,000 rpm的速度旋转5分钟,然后上样到凝胶中进电泳。

• 二、裂解和溶解为了使蛋白质能够进入分离凝胶,必须将样本进行裂解,因此样品制备的第一阶段是裂解。

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