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中盛溯源细胞培养教程-细胞复苏

细胞复苏,生物学的一种术语,是指将冻存在液氮或者-70℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养,细胞恢复生长的过程。...

 

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1. 从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀;
3. 离心, 1000rpm,5min;
4. 弃去上清液,加入含10%小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37℃培养箱静置培养;
5. 次日更换一次培养液,继续培养。

细胞复苏是与细胞冻存相反的过程,即是细胞恢复生长的过程,是将冻存在液氮或者-70℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养。当恢复到常温状态时,细胞的形态结构保持正常,生化反应即可恢复。与细胞冻存不同,细胞复苏过程升温要快,防止在解冻过程中水分进入细胞,形成冰晶,影响细胞存活。

主要步骤:
①将冷冻管从液氮中取出,迅速投入37℃水浴融化,细胞融化后要尽快(约1min)移出37℃水浴。37℃水浴时间延长会提高细胞死亡率,复苏过程中一般细胞死亡率在20%~25%之间。
②迅速用酒精棉球擦拭冷冻管外部杀菌消毒,然后放置在冰浴上。
③小心开启瓶盖,把细胞转入含有4mL培养基的培养瓶中,然后把培养瓶移至培养箱,26℃~28℃培养1h,让细胞贴壁。
④细胞贴壁后,小心移弃培养基,主要是去掉DMSO(悬浮生长细胞要通过离心沉淀除去DMSO)、死细胞及其碎片,加5mL新鲜培养基,26℃~28℃培养。
⑤细胞培养24h后,更换新鲜培养基,继续培养直到形成单层,便可以传代。
⑥详细记录复苏细胞的名称、数量、复苏时间、存放部位等。

结果分析:
判断细胞复苏成功与否,需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率(细胞存活率将冻存管内剩余的细胞,用台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率。呈蓝色的细胞为死细胞,活细胞不着色。用细胞计数板和计数器计数细胞,得出细胞存活率)。如果复苏后95%以上的细胞贴壁,而且细胞的活性好,这就说明细胞复苏的过程没有问题。复苏的细胞恢复到正常生长,达到正常的生长特性(比如细胞群体倍增时间等)后要再冻存以补充细胞储存数量。

注意事项:
1、注意无菌操作。
2、应在1-2min内使冻存液完全融化。如果复温速度太慢,则会造成细胞损伤。另外,细胞复苏后的操作最好在4℃冰浴中进行,以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。
3、细胞复苏过程中,升温的速率要大,把从液氮或-70℃冰箱中取出的细胞在最短的时间内放入水浴锅。
4、细胞放入水浴中注意用镊子夹住细胞冻存管并在水浴中不时晃动,使其受热均匀,并防止水浴时水进入细胞冻存管污染细胞。打开细胞冻存管之前要用酒精棉球将冻存管消毒并晾干。
5、液氮操作有一定的危险性,打开液氮罐取出细胞时,戴上防护眼镜。
6、如果冻存管密封不严,液氮可被吸入。由于解冻时冻存管中的气温急剧上升,将可能发生爆炸。复苏过程中应盖上恒温水浴锅的盖

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